Demonstration av självmonterad cellarksodling och manuell generering av en 3D-sena/ligamentliknande organoid med hjälp av humana dermala fibroblaster
Summary
Här demonstrerar vi en organoidmodell i tre steg (tvådimensionell [2D] expansion, 2D-stimulering, tredimensionell [3D] mognad) som erbjuder ett lovande verktyg för grundforskning om senor och en potentiell ställningsfri metod för senvävnadsteknik.
Abstract
Senor och ligament (T/L) är starka, hierarkiskt organiserade strukturer som förenar det muskuloskeletala systemet. Dessa vävnader har en strikt ordnad kollagen typ I-rik extracellulär matris (ECM) och T/L-linjeceller huvudsakligen placerade i parallella rader. Efter skada kräver T/L lång tid för rehabilitering med hög risk för fel och ofta otillfredsställande reparationsresultat. Trots de senaste framstegen inom T/L-biologisk forskning är en av de återstående utmaningarna att T/L-fältet fortfarande saknar ett standardiserat differentieringsprotokoll som kan rekapitulera T/L-bildningsprocessen in vitro. Till exempel kräver ben- och fettdifferentiering av mesenkymala prekursorceller endast vanlig tvådimensionell (2D) cellodling och tillsats av specifika stimuleringsmedier. För differentiering till brosk är tredimensionell (3D) pelletsodling och tillskott av TGFß nödvändig. Celldifferentiering till sena kräver dock en mycket ordnad 3D-odlingsmodell, som i idealfallet också bör vara föremål för dynamisk mekanisk stimulering. Vi har etablerat en 3-stegs (expansion, stimulering och mognad) organoidmodell för att bilda en 3D-stavliknande struktur av ett självmonterat cellark, vilket ger en naturlig mikromiljö med sina egna ECM, autokrina och parakrina faktorer. Dessa stavliknande organoider har en flerskiktad cellulär arkitektur inom rik ECM och kan hanteras ganska enkelt för exponering för statisk mekanisk belastning. Här demonstrerade vi 3-stegsprotokollet genom att använda kommersiellt tillgängliga dermala fibroblaster. Vi kunde visa att denna celltyp bildar robusta och ECM-rikliga organoider. Den beskrivna proceduren kan optimeras ytterligare när det gäller odlingsmedia och optimeras mot dynamisk axiell mekanisk stimulering. På samma sätt kan alternativa cellkällor testas för deras potential att bilda T/L-organoider och därmed genomgå T/L-differentiering. Sammanfattningsvis kan den etablerade 3D T/L-organoidmetoden användas som en modell för grundforskning om senor och till och med för ställningsfri T/L-teknik.
Introduction
Senor och ligament (T/L) är viktiga komponenter i muskuloskeletala systemet som ger viktigt stöd och stabilitet till kroppen. Trots sin avgörande roll är dessa bindväv benägna att degeneration och skadas, vilket orsakar smärta och försämring av rörligheten1. Dessutom kan deras begränsade blodtillförsel och långsamma läkningsförmåga leda till kroniska skador, medan faktorer som åldrande, repetitiva rörelser och felaktig rehabilitering ytterligare ökar risken för degeneration och skada2. Konventionella behandlingar, såsom vila, sjukgymnastik och kirurgiska ingrepp, kan inte helt återställa T/L-strukturen och funktionen. Under de senaste åren har forskare strävat efter att bättre förstå den intrikata karaktären hos T/L för att kunna söka effektiva behandlingar för T/L-störningar 3,4,5. T/L kännetecknas av en hierarkiskt organiserad, extracellulär matris (ECM)-dominerad struktur, som främst består av kollagenfibrer av typ I och proteoglykaner, en egenskap som är svår att replikera in vitro6. Traditionella tvådimensionella (2D) cellodlingsmodeller misslyckas med att fånga den karakteristiska tredimensionella (3D) organisationen av T/L-vävnader, vilket begränsar deras translationella potential samt hindrar innovativa framsteg inom området T/L-regenerering.
På senare tid har utvecklingen av 3D-organoidmodeller erbjudit nya möjligheter för att främja grundforskning och ställningsfri vävnadsteknik för olika vävnadstyper 7,8,9,10,11,12,13. Till exempel, för att undersöka myotendinous junction, utvecklade Larkin et al. 2006 3D-skelettmuskelkonstruktioner tillsammans med självorganiserade sensegment som härrör från råttsvanssena10. Dessutom riktade Schiele et al. 2013, genom att använda mikrobearbetade fibronektinbelagda tillväxtkanaler, självorganiseringen av humana dermala fibroblaster för att bilda cellulära fibrer utan hjälp av 3D-ställning, ett tillvägagångssätt som kan fånga viktiga egenskaper hos embryonal senutveckling11. I studien av Florida et al. 2016 utvidgades benmärgsstromaceller först till ben- och ligamentlinjer, därefter användes de för att generera självmonterade monolagercellark, som sedan implementerades för att skapa en multifasisk ben-ligament-benkonstruktion som efterliknar det ursprungliga främre korsbandet, en modell som syftar till förbättrad förståelse av ligamentregenerering12. För att belysa senmekanotransduktionsprocesser använde Mubyana et al. 2018 en ställningsfri metodik genom vilken enstaka senfibrer skapades och utsattes för mekanisk belastningsprotokoll13. Organoider är självorganiserade 3D-strukturer som efterliknar den ursprungliga arkitekturen, mikromiljön och funktionaliteten hos vävnader. 3D-organoidkulturer ger en mer fysiologiskt relevant modell för att studera vävnads- och organbiologi samt patofysiologi. Sådana modeller kan också användas för att inducera vävnadsspecifik differentiering av olika stam-/stamcellstyper14,15. Att implementera 3D-organoidmodeller inom T/L-biologi och vävnadsteknik blir därför ett mycket attraktivt tillvägagångssätt 9,16. Alternativa cellkällor kan implementeras för organoidsammansättningen och stimuleras mot tenogen differentiering. En relevant celltyp som används för demonstration i denna studie är dermala fibroblaster 7,17,18. Dessa celler är lättillgängliga genom en hudbiopsiprocedur, som är mindre invasiv jämfört med benmärgspunktion eller fettsugning och kan föröka sig ganska snabbt till ett stort antal på grund av deras goda proliferativa kapacitet. Däremot är mer specialiserade celltyper, såsom T/L-residenta fibroblaster, mer utmanande att isolera och expandera. Därför användes dermala fibroblaster också som en utgångspunkt för cellomprogrammeringstekniker mot inducerade pluripotenta embryonala stamceller19. Genom att utsätta dermala fibroblaster för specifika 3D-odlingsförhållanden och signalsignaler, såsom transforming growth factor-beta 3 (TGFß3), som har rapporterats fungera som en nyckelregulator för olika cellulära processer, inklusive bildning och underhåll av T/L, kan deras tenogena differentiering in vitro som leder till uttryck av senspecifika gener och deponering av T/L-typisk ECM20. 21. veckor
Här beskriver och demonstrerar vi ett tidigare etablerat och implementerat 3-stegs (2D-expansion, 2D-stimulering och 3D-mognad) organoidprotokoll med hjälp av kommersiellt tillgängliga normala vuxna humana dermala fibroblaster (NHDF) som cellkälla, vilket erbjuder en värdefull modell för att studera in vitro tenogenes7. Trots det faktum att denna modell inte är ekvivalent med in vivo T/L-vävnad, ger den fortfarande ett mer fysiologiskt relevant system som kan användas för att undersöka cellulära differentieringsmekanismer, efterlikna T/L-patofysiologi in vitro och etablera T/L-anpassade medicin- och läkemedelsscreeningplattformar. Dessutom kan studier i framtiden utvärdera om 3D-organoiderna är lämpliga för ställningsfri T/L-teknik genom ytterligare optimering samt kan användas för utveckling av uppskalade mekaniskt robusta konstruktioner som liknar dimensionerna och strukturella och biofysiska egenskaperna hos nativa T/L-vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resultaten som visas i denna studie ger värdefulla insikter i etableringen och karakteriseringen av NHDF 3D-organoidmodellen för studier av T/L-vävnader. 3-stegsprotokollet ledde till bildandet av 3D-stavliknande organoider som uppvisar typiska egenskaper hos T/L-nischen. Denna modell har tidigare rapporterats i Kroner-Weigl et al. 20237 och demonstreras i detalj här.
Faskontrastbilderna som presenterades i figur 2 visade progr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.D. och S.M.-D. erkänn BMBF-bidraget “CellWiTaL: Reproducible cell systems for drug research – transfer layer-free laser printing of highly specific single cells in three-dimensional cellular structures” Proposal Nr. 13N15874. D.D. och V.R.A. erkänner EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS “Holistisk utbildning av nästa generations artrosforskare” GA Nr. 101034412. Alla författare tackar Mrs. Beate Geyer för teknisk hjälp.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair – A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
