여기에서는 쥐의 대퇴골 이형성증 조직에서 box-cavity 결손을 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 모델은 생체역학적 스트레스 하에서 생체재료 성능을 평가하고 막내 골형성과 관련된 뼈 재생 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
심각한 뼈 결손이나 복잡한 골절은 유합 불필요 또는 불충분한 뼈 치유와 같은 심각한 합병증을 초래할 수 있습니다. 세포, 골격 및 사이토카인의 적용과 관련된 조직 공학은 뼈 재생을 위한 유망한 솔루션으로 간주됩니다. 결과적으로, 뼈 결손을 시뮬레이션하는 다양한 동물 모델은 뼈 치유를 위한 조직 공학의 치료 잠재력을 탐구하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 연구에서 우리는 쥐의 대퇴골 중앙에 상자 모양의 대뇌 피질 뼈 결손 모델을 구축했으며, 이는 뼈 치유를 촉진하는 생체 재료의 기능을 평가하기 위한 이상적인 모델 역할을 할 수 있습니다. 이 상자 모양의 피질 뼈 결손은 구강 저속 핸드피스를 사용하여 뚫고 선반 바늘로 모양을 잡았습니다. 수술 후 micro-CT 분석을 즉시 실시하여 box-cavity cortical bone 결손의 성공적인 확립을 확인했습니다. 그런 다음 쥐의 수술한 쪽에 있는 대퇴골을 수술 후 여러 시점(0일, 2주, 4주 및 6주)에서 수확했습니다. 각 샘플의 결손 부위의 치유 과정은 micro-CT, hematoxylin 및 eosin(H&E) 염색, Masson 트리크롬 염색을 사용하여 평가되었습니다. 이러한 결과는 intramagranous ossification과 일치하는 치유 패턴을 보여주었으며, 치유는 본질적으로 6주까지 완료되었습니다. 이 동물 모델의 치유 과정의 분류는 뼈 조직 결손 치유 중 막내 골화를 표적으로 하는 새로운 생체 재료 및 약물을 조사하기 위한 효과적인 in vivo 방법을 제공합니다.
서론
골절 및 결손은 종종 외상, 종양, 염증 및 선천성 기형으로 인해 발생합니다 1,2. 젊고 건강한 사람의 뼈 조직은 일반적으로 강력한 재생 능력을 가지고 있지만3 전신 질환(예: 당뇨병, 골다공증 및 감염)으로 인한 임계 크기를 초과하는 결함이나 치유 장애는 여전히 뼈 불연속성 또는 치유 장애와 같은 합병증을 유발할 수 있습니다4. 이러한 임상적 문제를 해결하기 위해 뼈 이식 또는 생체 재료는 일반적으로 심각한 결함이 있는 뼈를 대체하거나 큰 뼈 부분을 재건하는 데 사용됩니다. 그러나 이러한 치료법에는 한계가 있습니다. 예를 들어, 자가 골 이식술은 황금 표준으로 간주되지만 기증자 공급이 제한되고 잠재적인 기증자 부위 합병증으로 어려움을 겪습니다 5,6. 동종이식은 또한 면역 매개 거부 반응, 질병의 잠재적 전염, 이식편의 생체역학적, 생물학적 특성에 대한 부정적인 영향과 같은 특정 위험을 제시한다7.
최근 몇 년 동안 뼈 결손 치유 메커니즘에 초점을 맞춘 연구가 급증했습니다. 대체 생체 재료의 사용과 조직 공학의 발전은 뼈 재생 분야에서 중요한 주제로 부상했다8. 이러한 생체 재료가 인간 치료에 적용되기 전에 효능과 안전성을 보장하기 위해 시험관 내 및 생체 내 테스트를 거쳐야 합니다. 그러나 in vitro 환경의 복잡성이 감소하고 면역 및 염증 반응이 없기 때문에 in vitro에서 다양한 생체 재료의 평가가 제한됩니다. 따라서 다양한 유형의 뼈 조직 결손에 대한 동물 모델의 확립이 필요하다9. 동물 모델을 통해 다양한 로딩 조건에서 생체 재료를 평가할 수 있고, 종별 뼈 특성에 대한 이해를 촉진하며, 동물 모델과 인간 임상 상황 간의 유사성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이러한 장점은 뼈-골격 상호작용을 연구하고 연구 결과를 임상 실습에 적용하는 데 필수적입니다 9,10.
현재 기계적 뼈 결손 동물 모델은 생체 재료의 성능을 검증하는 데 널리 사용되고 있으며, 두개골 결손 모델과 분절 골 결손 모델이 가장 일반적으로 적용되는 방법이다11. 뼈 불유합으로 끝나는 심각한 긴 뼈 또는 경골 외상을 모방하는 데 자주 사용되는 분절 골 결손 모델은 균일한 치수와 정의된 해부학적 위치로 인해 유리하며 새로운 뼈 형성 및 혈관 재생에 대한 방사선학적 또는 조직학적 평가를 단순화합니다. 그러나 이러한 모델은 양측 골절 분절을 안정화하기 위해 금속 임플란트가 필요하며 내연골 및 막내 골화(intramembraneranous ossification)를 모두 포함하는 복잡한 치유 과정을 필요로 한다12. 반면에, 종아리골 결손 모델은 표준화된 결손 직경, 편리한 수술 접근, 경막 및 연조직의 지지 기능으로 인해 생체 재료를 평가하기 위한 주요 스크리닝 도구가 되었다13. 이들은 임상적으로 관련된 시나리오에서 골내 골 형성을 모델링하는 데 널리 사용되지만, 치유 과정 동안 하중을 지지 않는 특성으로 인해 생체 역학적 하중 조건에서 뼈 치유를 평가하는 데 적합하지 않습니다14.
이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 쥐의 대퇴골 이완증 조직에서 box-cavity cortical bone defect model을 확립했습니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT), 3차원(3D) 재구성 및 조직 병리학적 염색(Hematoxylin 및 eosin[HE] 및 Masson)을 활용하여 지혈 조건에서 이 모델의 치유 과정을 분석했습니다. 우리는 생체 역학적 하중 조건에서 생체 재료 성능을 평가하고 막내 골화에 대한 뼈 재생의 생체 공학 및 메커니즘을 연구하기 위한 새로운 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다.
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프로토콜
이 연구의 모든 동물 시술은 쓰촨 대학교 중국 서부 구강 학교 윤리 위원회(WCHSIRB-D-2021-597)에서 검토하고 승인했습니다. 본 연구에는 Sprague-Dawley 랫트(수컷, 체중 300g)가 사용되었습니다.
1. 수술 전 준비
- 기기 준비
- 이 연구에 사용된 수술 기구에 대해서는 그림 1A 를 참조하십시오: 전기 면도기, 조직 가위, 안과 가위, 안과 겸자, 일회용 메스, 골막 분리기, 구강 저속 핸드피스, 구강 프로브, 일회용 세척 진공 청소기, 바늘 홀더, 3.0 봉합사.
- 구강 프로브를 준비하고 결함의 직경에 따라 마커 펜으로 프로브의 큰 구부러진 끝을 표시합니다(그림 1B). 이를 사용하여 수술 중 결함의 크기를 확인합니다.
- 사용하기 전에 시술을 수행하는 데 사용되는 모든 수술 재료와 기구를 멸균하십시오. 원하는 재료를 접힌 천이나 포장지에 포장하고 증기 멸균을 위해 오토클레이브 테이프로 밀봉합니다(125-135°C에서 20-25분 동안).
- 수술 부위 준비: 75% 알코올을 분사하여 수술대와 수술대 주변 환경을 소독합니다. 수술대에 약 60cm x 90cm의 멸균 구역을 만들고 오토클레이브 드레이프를 만듭니다.
- 마취 준비
- 10% 케타민 하이드로클로라이드(50-100mg/kg) 및 2% 자일라진 2mg/kg으로 쥐를 복강내 마취합니다. 수술 전 및 수술 중 진통을 위해 카프로펜(5mg/kg)의 피하 주사를 사용합니다. 발가락 끼기 테스트로 마취 깊이를 검사합니다. 마취 후 멸균 안연고를 눈에 바르면 안구 건조증과 각막 손상을 예방할 수 있습니다.
2. 수술 절차
- 멸균 수술 테이블에 쥐를 옆으로 누운 위치에 놓고 전기 면도기로 하지 털을 제거합니다.
- 5% 요오드화 용액과 75% 알코올을 사용하여 수술 부위의 피부 조직을 소독합니다.
- 근위 및 원위 대퇴골을 찾아 대퇴골의 긴 축을 따라 2.5cm를 절개하여 쥐의 피부 조직을 절단합니다.
- 안과용 집게와 조직 가위로 근막에서 피부층을 분리하고 대퇴 이두근과 대퇴 외측 근육을 통해 대퇴골에 대한 측면 접근을 노출시킵니다.
- 두 근육 격막(흰색 조직 라인)의 교차점을 찾고 대퇴골 표면에 도달할 때까지 근육 경계를 따라 일회용 수술용 칼날로 조심스럽게 분리합니다.
알림: 일회용 칼날을 사용하여 근육을 분리할 때는 근육 중격을 따라 분리하는 것이 중요하며 연조직 내에서 혈관 손상을 일으키지 않도록 주의해야 합니다. 초보자와 해부학에 익숙하지 않은 사람들은 두 근육 덩어리 사이의 둔한 절개에 안과 겸자와 골막 분리기를 사용해야 합니다.
- 골막 분리기를 적용하여 대퇴골 표면 근육을 뭉툭하게 분리하고 대퇴골 골격의 중앙을 노출시킵니다.
- 멸균 마커 펜을 사용하여 대퇴골두의 측면 1/3 비스듬한 능선 상단에 위치한 대퇴골 골격의 중간 표면에 결손 부위 영역을 표시합니다.
- 직경 1.2mm의 슬로우 모션 볼 드릴이 있는 구강 저속 핸드피스를 사용하여 표시된 부위의 뼈 표면에 수직인 작은 구멍을 뚫어 골수강에 도달할 수 있을 만큼 깊은 깊이로 골막과 뼈 피질을 파괴합니다. 이 드릴링 깊이 레벨에서 이 깊이에 평행한 구멍의 크기를 모든 방향으로 확장하고 트리밍하여 상자 캐비티 쉐이프를 만듭니다.
- 결손의 가장자리와 평행하게 라벨이 부착된 구강 프로브를 사용하여 준비 중 및 준비 후에 결손 직경과 형태를 결정합니다.
- 근육과 피부층을 각각 3-0 모노필라멘트 흡수성 봉합사로 봉합하고 수술 부위를 5% 요오드포로 안쪽에서 바깥쪽으로 소독합니다.
3. 수술 후 관리
- 수술 후 카프로펜(5mg/kg)을 피하주사하고 마취가 회복될 때까지 쥐를 일정한 온도의 가열 패드에 올려 놓는다. 쥐가 의식을 되찾으면 건조한 고압멸균 침구가 들어 있는 케이지로 부드럽게 옮깁니다.
- 수술 후 24시간 동안 진통을 계속하고 수술 후 1주일 동안 수술 후 모니터링을 계속합니다.
4. 시료 채취 및 분석
- 수술 후 펜토바르비탈 나트륨 100-200mg/kg을 복강내로 주입하여 쥐를 인간적으로 안락사시킵니다. 대퇴골 표면의 근육과 근막 조직을 조심스럽게 분리하고 수술 측의 대퇴골을 완전히 제거합니다. 수술 후 0일(그림 2A, B), 2주, 4주, 6주에 검체를 채취합니다.
- 대퇴골 표본을 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 고정합니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 대퇴골의 구조를 분석합니다. 스캐닝 매개변수를 다음과 같이 설정하십시오: X선관 전위, 70kVp; 필터, AL 0.5mm; X선 강도, 0.2mA; 복셀 크기, 17μm; 통합 시간, 1 × 300 ms. 비트맵 데이터를 사용하여 3D 모델 이미지를 재구성할 수 있습니다.
- 등급이 매겨진 일련의 에탄올 희석액에서 대퇴골 표본을 탈수하기 전에 10% EDTA에서 검체를 8주 동안 석회질화합니다. 그런 다음 샘플을 파라핀 왁스15에 묻습니다.
- 포함된 샘플을 시상면에서 5μm 파라핀 섹션으로 자릅니다.
- hematoxylin 및 eosin(H&E) 염색 키트와 Masson 염색 키트를 사용한 염색 섹션. 조직 병리학에 의한 결손 부위의 치유를 관찰합니다.
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결과
이 프로토콜에서는 드릴링을 통해 4.5mm x 1.5mm 크기의 쥐 대퇴골 상자 공동 결함 모델을 성공적으로 구축했습니다. 치유과정을 분석하기 위해 수술 후 0일, 2주, 4주, 6주에 수술 부위의 대퇴 조직을 채취하였는데, 이는랫트의 대퇴 외상 치유 과정에서 내연골 골화, 골내 골화, 골변형이 이루어지는 주요 시점이다. 수술 후 0일차에 micro-CT 비트맵 데이터에서 3D 모델을 재구성한 결과, 골수강까지 4.5mm x 1.5mm 깊이의 대퇴골의 상자 공동 결손을 성공적으로 모델링한 것으로 나타났습니다(그림 3A). micro-CT 결과는 모델 생성 2주 후에 대뇌 피질 뼈 결손의 틈새 공간에서 광물화된 섬유주 뼈 형성을 보여주었습니다(그림 3B). 결손 부위의 새로운 뼈 조직 표면은 성숙하고 조밀한 피질 뼈를 보여주...
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토론
전임상 동물 모델은 뼈 치유와 생체 재료가 뼈 재생에 미치는 영향을 조사하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 임상적 골 재생과 관련된 막내 골 형성 과정을 복제하는 대퇴골 상자강 결손 모델을 보여줍니다. 결손 부위는 사전 표시된 구강 프로브를 사용하여 수술 중 표준화되었습니다. Micro-CT 및 조직병리학적 염색 결과, 6주에 걸쳐 점진적인 치유가 보였으며 골막이 두꺼워지고 새로운 섬유주 뼈가 형성된 후 조밀한 피질 뼈가 형성되었습니다. 치유 과정에서 연골 조직이 관찰되지 않았으며, 이는 막내 골형성을 나타냅니다. 이 발견은 임상적 뼈 재생에서 생체 재료 또는 약물의 역할을 연구하기 위한 새로운 관점을 제시합니다.
이 프로토콜은 다음과 같은 몇 가지 요소에 세심한 주의를 기울여야 합니다: (i) 심부 마취는 동물의 고통을 예방하고 정확한 결함 위치 파악을 보장하기 위한 전제 조건입니다. 마취 깊이와 활력 징후를 주의 깊게 모니터링해야 합니다. (ii) 근육 분리 중에는 회복을 ...
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공개 사항
모든 원본 데이터와 이미지가 이 백서에 포함되어 있습니다. 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 82101000 (HW), U21A20368 (LY) 및 82100982 (FL)의 보조금으로 자금을 지원했으며 쓰촨 과학 기술 프로그램 2023NSFSC1499 (HW)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.2mm 저속 볼 드릴 | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | 상자 캐비티 결함 |
| 3.0 봉합 | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | 없음 | 봉합 상처용 |
| 4% 파라포름알데히드 | Biosharp | BL539A | 대퇴골 표본 고정용 |
| 면봉 Haishi | Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | 피부 살균 및 수술 분야의 청소를 위해 |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | 피부 소독용 |
| 치과 기공사 연삭기 | 마라톤 | N3-140232 | 상자 캐비티 결함 준비용 |
| 일회용 메스 | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | 피부 절개 부위 및 근육 조직을 뚜렷하게 분리하기 위해 |
| 전기 면도기 | JASE | BM320210 | 수술 부위의 모발 조직 제거 |
| Hematoxylin 및 Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | 검체의 조직학적 분석용 |
| Masson' s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | 표본의 조직학적 분석을 위한 |
| Micro CT | Scanco medical, ag | µ CT 45 | 대퇴 샘플의 결함 치유 분석을 위해 |
| 바늘 홀더 | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | 없음 | 봉합사 고정 바늘 용 |
| 올림푸스 연구 등급 전체 슬라이드 스캐닝 시스템 VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | HE 염색 및 Masson 염색 |
| 안과 겸자 | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | 없음 | 피부, 근육 조직 클램핑용 |
| 안과 가위 | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | 없음 | 피부 절개 접근 방식을 형성하기 위해 |
| 구강 저속 핸드피스 | 마라톤 | Y221101003 | 상자 구멍 결함 준비를 위해 |
| 구강 프로브 | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | 결함의 직경 측정용 |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | 없음 | 근육 조직의 둔탁한 분리를 위해 |
| Sprague– Dawley 쥐 | Byrness Weil Biotech Ltd | 없음 | 대퇴골 boxy cavitary 결함 |
| 조직 가위 | Chengdu Shifeng Co., Ltd.의 | 없음 | : 피부 절개 접근법을 형성하기 위해 |
참고문헌
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- Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. Clifford, J., Rosen, M. D. , Wiley-Blackwell, UK. (2019).
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재인쇄 및 허가
