通过荧光抗体注射观察活果蝇胚胎中的低丰度蛋白质和翻译后修饰
Summary
该协议描述了定制的基于抗体的荧光标记和注射到早期 果蝇 胚胎中，以实现使用传统GFP / mCherry标签方法难以检测的低丰度蛋白质或翻译后修饰的实时成像。
Abstract
使用 GFP（绿色荧光蛋白）和其他荧光标签对活细胞中的蛋白质进行可视化，极大地提高了对蛋白质定位、动力学和功能的理解。与免疫荧光相比，实时成像更准确地反映了蛋白质的定位，而不会因组织固定而产生潜在的伪影。重要的是，实时成像能够对蛋白质水平和定位进行定量和时间表征，这对于理解细胞运动或分裂等动态生物过程至关重要。然而，荧光标记方法的一个主要局限性是需要足够高的蛋白质表达水平才能实现成功的可视化。因此，无法检测到许多表达水平相对较低的内源性标记荧光蛋白。另一方面，使用病毒启动子的异位表达有时会导致蛋白质错定位或生理环境中的功能改变。为了解决这些局限性，提出了一种在活胚胎中利用高灵敏度抗体介导的蛋白质检测的方法，基本上无需组织固定即可进行免疫荧光。作为原理证明，在活胚胎中几乎无法检测到的内源性 GFP 标记的 Notch 受体在抗体注射后可以成功可视化。此外，这种方法适用于可视化活胚胎中的翻译后修饰 （PTM），允许检测早期胚胎发生过程中酪氨酸磷酸化模式的时间变化，并揭示顶膜下磷酸酪氨酸 （p-Tyr） 的新亚群。这种方法可以修改以适应其他蛋白质特异性、标签特异性或 PTM 特异性抗体，并且应该与其他适合注射的模式生物或细胞系兼容。该协议为低丰度蛋白质或PTM的实时成像开辟了新的可能性，而这些蛋白质或PTM以前很难使用传统的荧光标记方法进行检测。
Introduction
免疫荧光是现代细胞生物学的一项基石技术，最初由 Albert Coons 开发，它能够检测其天然细胞区室的分子并表征亚细胞器或机器的分子组成1。结合基因操作，免疫荧光有助于建立现在广为接受的概念，即蛋白质定位对其功能至关重要2。除了特异性一抗和明亮的荧光染料外，该技术的成功还依赖于称为固定和透化的初步过程，该过程保留了细胞形态，固定了抗原，并增加了抗体进入细胞内区室的可及性。不可避免地，固定和透化过程会杀死细胞并终止所有生物过程3.因此，免疫荧光仅提供蛋白质生命旅程的快照。然而，许多生物过程（如细胞迁移和分裂）本质上是动态的，需要以时空分辨的方式研究蛋白质行为4,5。
为了研究生物体中的蛋白质动力学，已经开发了基于基因编码荧光蛋白（如绿色荧光蛋白 （GFP）6 和高速共聚焦显微镜）的实时成像方法。简而言之，目标蛋白可以通过基因操作与GFP7融合，然后从病毒或酵母启动子（如巨细胞病毒（CMV）8 或上游激活序列（UAS）9）异位表达。由于GFP本质上是自发荧光的，因此不需要荧光团偶联抗体来揭示靶蛋白的定位，从而绕过了固定或透化的初步过程的必要性。在过去的二十年中，已经开发了跨越整个波长光谱的荧光标签10，可以同时对多种靶蛋白进行多色实时成像。然而，与化学工程荧光染料（如AlexaFluor或ATTO）相比，这些基因编码的荧光蛋白的自发荧光在内源性启动子表达时相对较弱且不稳定，特别是在较长时间尺度的实时成像期间10。虽然这种不足可以通过过度表达荧光标记的靶蛋白来缓解，但许多具有酶活性的蛋白（如激酶和磷酸酶）如果不在生理水平上表达，会严重破坏正常的生物过程。
该协议提出了一种在实时图像设置中实现基于光稳定抗体的靶标照明的方法，基本上允许免疫荧光，而无需固定或透化过程（图1）。通过简单的基于 NHS 的伯胺反应11，可以将荧光染料（如 AlexaFluor 488 或 594）与基本上任何一抗或 GFP/HA/Myc 纳米抗体12 偶联。利用所有 果蝇 胚胎细胞在第 13 阶段共享共同细胞质的发育特征，可以在注射染料偶联抗体后实现整个胚胎的抗原结合和照明。随着 果蝇 和其他模型系统14中可用的内源性标记蛋白库的扩展，该方法可以通过揭示活组织中低丰度荧光标记蛋白和其他非荧光标记（HA/Myc标记）蛋白的动力学来潜在地扩大这些文库的应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
该介绍的程序概述了使用定制抗体进行荧光标记并随后注射到早期 果蝇 胚胎中的专用方法。该技术有助于实时可视化少量存在的蛋白质或翻译后修饰，这些蛋白质或翻译后修饰通常难以通过传统的GFP/mCherry标记方法观察到。
在扩展该方法以在野生型和突变型胚胎之间进行定量比较时应谨慎行事。虽然在免疫荧光中，对照组和实验组之间的一抗和二抗浓度可以保持相同?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢 Jennifer A. Zallen 博士提供 Sqh-GFP 果蝇 品系并为该技术的初始开发提供支持，并感谢 Francois Schweisguth 博士提供 Notch-GFP 果蝇 品系。这项工作得到了中国国家自然科学基金（32270809）对H.H.Yu的资助，南方科技大学生命科学学院的慷慨资助和人员支持，以及深圳市科学技术创新委员会/JCYJ20200109140201722对Y. Yan的资助。
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
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