Summary

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

Published: January 19, 2024
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Summary

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ の初期胚への注入について説明します。

Abstract

GFP(Green Fluorescent Protein)やその他の蛍光タグを用いて生細胞内のタンパク質を可視化することで、タンパク質の局在、動態、機能の理解が大幅に向上しました。免疫蛍光法と比較して、ライブイメージングは、組織固定から生じる潜在的なアーチファクトなしに、タンパク質の局在をより正確に反映します。重要なことは、ライブイメージングにより、細胞の動きや分裂などの動的な生物学的プロセスを理解するために重要な、タンパク質レベルと局在の定量的および時間的特性評価が可能になることです。しかし、蛍光標識法の主な制限は、可視化を成功させるために十分に高いタンパク質発現レベルが必要であることです。その結果、発現レベルが比較的低い内因性タグ付き蛍光タンパク質の多くは検出できません。一方、ウイルスプロモーターを用いた異所性発現は、生理学的状況におけるタンパク質の誤局在や機能的変化につながることがあります。これらの制限に対処するために、生体胚における高感度の抗体媒介タンパク質検出を利用し、本質的に組織固定を必要とせずに免疫蛍光を実行するアプローチが提示されます。原理の証明として、生体胚ではほとんど検出できない内因性GFPタグ付きノッチ受容体を、抗体注入後にうまく可視化することができます。さらに、このアプローチは、生きた胚の翻訳後修飾(PTM)を可視化するために適用され、初期胚発生中のチロシンリン酸化パターンの経時的変化の検出を可能にし、頂端膜下のホスホチロシン(p-Tyr)の新しい亜集団を明らかにしました。このアプローチは、他のタンパク質特異的抗体、タグ特異的抗体、またはPTM特異的抗体に対応するように変更することができ、他の注入に適したモデル生物または細胞株と適合性があるはずです。このプロトコルは、従来の蛍光タグ法では検出が困難であった低存在量タンパク質またはPTMのライブイメージングに新たな可能性を開きます。

Introduction

免疫蛍光法は、アルバート・クーンズによって最初に開発された現代細胞生物学の基礎技術であり、天然の細胞区画で分子を検出し、細胞内オルガネラまたは機械の分子組成の特性評価を可能にします1。遺伝子操作と相まって、免疫蛍光法は、タンパク質の局在化がその機能に不可欠であるという、現在広く受け入れられている概念の確立に役立ちます2。この技術の成功は、特異的な一次抗体と明るい蛍光色素の他に、細胞形態を維持し、抗原を固定化し、細胞内コンパートメントへの抗体のアクセス性を高める固定および透過化という予備プロセスに依存しています。必然的に、固定と透過のプロセスは細胞を殺し、すべての生物学的プロセスを終了させます3。したがって、免疫蛍光法は、タンパク質のライフジャーニーのスナップショットを提供するだけです。しかし、細胞の遊走や分裂などの多くの生物学的プロセスは本質的に動的であり、時空間的に分解された方法でタンパク質の挙動を調べる必要があります4,5

生体内の蛋白質動態を調べるために、緑色蛍光蛋白質(GFP)6 などの遺伝子にコードされた蛍光蛋白質を用いたライブイメージング法や高速共焦点顕微鏡が開発されています。簡単に説明すると、目的のタンパク質を遺伝子操作してGFP7と融合させ、サイトメガロウイルス(CMV)8 や上流活性化配列(UAS)9などのウイルスまたは酵母のプロモーターから異所的に発現させることができます。GFPは本質的に自家蛍光であるため、標的タンパク質の局在を明らかにするために蛍光色素結合抗体は必要なく、固定または透過処理の予備プロセスの必要性を回避します。過去20年間で、波長の全スペクトルにわたる蛍光タグが開発され10、複数の標的タンパク質のマルチカラーライブイメージングを同時に可能にしました。しかし、AlexaFluorやATTOなどの化学的に操作された蛍光色素と比較して、これらの遺伝的にコードされた蛍光タンパク質の自家蛍光は、内因性プロモーターから発現する場合、特により長い時間スケールにわたるライブイメージング中に、比較的弱く不安定である10。この不足は、蛍光タグ付き標的タンパク質を過剰発現させることで軽減できますが、キナーゼやホスファターゼなどの酵素活性を持つ多くは、生理学的レベルで発現しない場合、正常な生物学的プロセスを著しく破壊します。

このプロトコルは、ライブ画像セットアップで光安定性抗体ベースのターゲット照明を可能にする方法を示しており、固定または透過処理のプロセスなしで本質的に免疫蛍光を可能にします(図1)。単純なNHSベースの第一級アミン反応11により、AlexaFluor 488や594などの蛍光色素を、基本的に任意の一次抗体またはGFP/HA/Mycナノボディ12と結合させることができます。ショウ ジョウバエ の胚細胞は合胞体期13で共通の細胞質を共有するという発生上の特徴を利用して、色素標識抗体の注入後、胚全体にわたる抗原結合と照明を達成することができます。ショウ ジョウバエ やその他のモデル系で利用可能な内因性タグ付きタンパク質のライブラリが拡大しているため14、この方法は、生体組織における少量の蛍光タグ付きタンパク質およびその他の非蛍光タグ付き(HA / Mycタグ付き)タンパク質のダイナミクスを明らかにすることにより、これらのライブラリのアプリケーションを潜在的に広げることができます。

Protocol

実験は、SUSTech University生命科学部のガイドラインと承認に従って行われました。使用される生物はショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)で、遺伝子型はNotch-Knockin-GFP(染色体X)とSqh-sqh-GFP(染色体II)で、それぞれフランソワ・シュヴァイスグース博士(パスツール研究所)とジェニファー・ザレン博士(スローン・ケタリング研究所)の研究室から寛大に提供されました。このプロトコルが抗体の…

Representative Results

蛍光タグベースのライブイメージングや免疫蛍光法に対する抗体注入法の利点を実証するために、存在量の少ない膜貫通受容体であるNotchの動的局在と、生きた胚におけるチロシンリン酸化と呼ばれる翻訳後修飾の一種を特徴付ける2つのケーススタディを提供します。 ノッチシグナル伝達活性は、胚発生および成体臓器の恒常性維持における細胞運命の決定に大きな役?…

Discussion

この手順では、カスタム抗体による蛍光標識と、その後の初期段階の ショウジョウバエ 胚への注入の特殊な方法の概要を説明します。この手法により、従来のGFP/mCherryタグ法では観察が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾をリアルタイムで可視化することができます。

この方法を拡張して野生型胚と変異胚の定量的比較を行う場合は注意が必要です。一次抗体?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sqh-GFP ショウジョウバエ ラインを提供し、この技術の初期開発を支援してくださったJennifer A. Zallen博士と、Notch-GFPショウ ジョウバエ ラインを提供してくれたFrancois Schweisguth博士に感謝します。この研究は、中国国家自然科学基金会(32270809)からH.H.Yuへの資金提供、SUSTech生命科学院からの寛大な財政的およびスタッフ的支援、および深セン科学技術イノベーション委員会/JCYJ20200109140201722からのY. Yanへの資金提供によって支援されました。

Materials

Agarose Sangon Biotech  A620014 
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit Invitrogen  A20185 Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope SOPTOP EX20 Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-4
Centrifuge Eppendorf 5245
Cell Strainer FALCON 352350
Desiccation chamber  LOCK&LOCK HSM8200 320ml
Dissecting Microscope Mshot MZ62 Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape Scotch 665
Fine Super Tweezer VETUS ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles Fisherbrand 12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Forcep VETUS 33A-SA
Halocarbon oil 27 Sigma-Aldrich H8773-100ML
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898-100ML
Heptane Sigma-Aldrich H2198-1L Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent  TOKAI 1-7315-01 Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Micropipette puller World Precision Instruments PUL-1000 Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50.
Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 
Pneumatic picopump World Precision Instruments PV 830 Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20 Santa Cruz SC-508
Square petri dishes Biosharp BS-100-SD
GFP nanobody Chromotek gt

References

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Zheng, Q., Xiang, X., Yan, Y., Yu, H. H. Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection. J. Vis. Exp. (203), e66080, doi:10.3791/66080 (2024).

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