형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화
Summary
이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.
Abstract
GFP(Green Fluorescent Protein) 및 기타 형광 태그를 사용하여 살아있는 세포의 단백질을 시각화하면 단백질 국소화, 역학 및 기능에 대한 이해가 크게 향상됩니다. 면역형광과 비교했을 때, 실시간 이미징은 조직 고정으로 인해 발생할 수 있는 잠재적인 아티팩트 없이 단백질 국소화를 더 정확하게 반영합니다. 중요한 것은 라이브 이미징을 통해 단백질 수준과 국소화의 정량적 및 시간적 특성 분석이 가능하며, 이는 세포 이동 또는 분열과 같은 역동적인 생물학적 과정을 이해하는 데 매우 중요하다는 것입니다. 그러나 형광 태깅 접근법의 주요 한계는 성공적인 시각화를 달성하기 위해 충분히 높은 단백질 발현 수준이 필요하다는 것입니다. 결과적으로, 상대적으로 낮은 발현 수준을 가진 많은 내인성 표지 형광 단백질은 검출될 수 없습니다. 반면에, 바이러스 프로모터를 사용한 이소성 발현은 때때로 생리학적 맥락에서 단백질의 국소화 불량 또는 기능적 변화를 초래할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 살아있는 배아에서 고감도 항체 매개 단백질 검출을 활용하여 조직 고정 없이 면역형광을 수행하는 접근 방식이 제시됩니다. 원리의 증거로, 살아있는 배아에서 거의 검출할 수 없는 내인성 GFP 태그 노치 수용체는 항체 주입 후 성공적으로 시각화할 수 있습니다. 또한, 이 접근법은 살아있는 배아의 번역 후 변형(PTM)을 시각화하도록 조정되어 초기 배아 발생 중 티로신 인산화 패턴의 시간적 변화를 감지하고 정점 막 아래에 있는 포스포티로신(p-Tyr)의 새로운 하위 집단을 밝힐 수 있습니다. 이 접근법은 다른 단백질 특이적, 태그 특이적 또는 PTM 특이적 항체를 수용하도록 수정할 수 있으며 다른 주입 가능 모델 유기체 또는 세포주와 호환되어야 합니다. 이 프로토콜은 기존의 형광 태깅 방법을 사용하여 검출하기 어려웠던 저농도 단백질 또는 PTM의 실시간 이미징을 위한 새로운 가능성을 열어줍니다.
Introduction
면역형광은 앨버트 쿤스(Albert Coons)가 처음 개발한 현대 세포 생물학의 초석 기술로, 본래 세포 구획에서 분자를 검출하고 세포 내 세포 소기관 또는 기계의 분자 조성을 특성화할 수 있습니다1. 유전자 조작과 결합된 면역형광은 단백질 국소화가 그 기능에 필수적이라는 현재 잘 받아들여지고 있는 개념을 확립하는 데 도움이 됩니다2. 특정 1차 항체 및 밝은 형광 염료 외에도 이 기술의 성공은 세포 형태를 보존하고 항원을 고정하며 세포 내 구획에 대한 항체의 접근성을 높이는 고정 및 투과화라는 예비 공정에 달려 있습니다. 필연적으로 고정 및 투과화 과정은 세포를 죽이고 모든 생물학적 과정을 종료합니다3. 따라서 면역형광은 단백질의 생애 여정에 대한 스냅샷만 제공합니다. 그러나 세포 이동 및 분열과 같은 많은 생물학적 과정은 본질적으로 동적이므로 공간-시간적으로 분해되는 방식으로 단백질 거동을 조사해야 합니다 4,5.
살아있는 유기체의 단백질 역학을 조사하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)6 및 고속 컨포칼 현미경과 같은 유전적으로 인코딩된 형광 단백질을 기반으로 하는 라이브 이미징 방법이 개발되었습니다. 간단히 말해서, 관심있는 단백질은 GFP7과 융합되도록 유전적으로 조작 될 수 있으며, cytomegalovirus (CMV) 8 또는 upstream activation sequence (UAS) 9와 같은 바이러스 또는 효모 프로모터로부터 ectopically 발현 될 수 있습니다. GFP는 성격에서 autofluorescent 이기 때문에, 아무 형광단도 결합한 항체는 기정 침투성의 예비적인 과정의 필요를 우회하는 표적 단백질의 지방화를 계시하기 위하여 요구되지 않습니다. 지난 20년 동안 전체 파장 스펙트럼에 걸쳐 형광 태그가 개발되어10 여러 표적 단백질의 다색 라이브 이미징을 동시에 수행할 수 있습니다. 그러나, AlexaFluor 또는 ATTO와 같은 화학적으로 조작된 형광 염료와 비교하여, 이러한 유전적으로 암호화된 형광 단백질의 자가형광은 내인성 프로모터로부터 발현될 때, 특히 장시간 스케일에 걸친 라이브 이미징 중에 상대적으로 약하고 불안정하다10. 이러한 결핍은 형광 표지된 표적 단백질을 과발현시킴으로써 완화될 수 있지만, 키나아제 및 인산가수분해효소와 같은 효소 활성을 가진 많은 단백질은 생리학적 수준에서 발현되지 않을 경우 정상적인 생물학적 과정을 심각하게 방해합니다.
이 프로토콜은 실시간 이미지 설정에서 광안정성 항체 기반 표적 조명을 가능하게 하는 방법을 제시하며, 기본적으로 고정 또는 투과화 과정 없이 면역형광을 허용합니다(그림 1). 간단한 NHS 기반 1차 아민 반응(11)을 통해 AlexaFluor 488 또는 594와 같은 형광 염료를 본질적으로 모든 1차 항체 또는 GFP/HA/Myc nanobody(12)와 접합할 수 있습니다. 모든 초파리 배아 세포가 싱크리튬(syncytium) 단계13 동안 공통 세포질을 공유한다는 발달적 특징을 이용하여, 염료 접합 항체를 주입한 후 전체 배아에 걸쳐 항원 결합 및 조명을 달성할 수 있습니다. 초파리(Drosophila ) 및 다른 모델 시스템(14)에서 이용 가능한 내인성 표지 단백질의 라이브러리가 확장됨에 따라, 이 방법은 살아있는 조직에서 저농도 형광 표지 단백질 및 기타 비형광 표지(HA/Myc-표지) 단백질의 역학을 밝혀냄으로써 잠재적으로 이들 라이브러리의 응용을 확대할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 제시된 절차는 맞춤형 항체를 사용한 형광 표지 및 초기 단계 의 초파리 배아에 대한 후속 주입의 특수 방법을 간략하게 설명합니다. 이 기술은 소량으로 존재하고 일반적으로 기존의 GFP/mCherry 태깅 방법을 통해 관찰하기 어려운 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 시각화를 용이하게 합니다.
야생형 배아와 돌연변이 배아를 정량적으로 비교하기 위해 이 방법을 확?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sqh-GFP 초파리 라인을 제공하고 이 기술의 초기 개발을 지원해 주신 Jennifer A. Zallen 박사와 Notch-GFP Drosophila 라인을 제공해 주신 Francois Schweisguth 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(National Natural Science Foundation of China, 32270809)이 H.H.Yu에게 자금을 지원하고, 생명과학부(School of Life Sciences, SUSTech)의 관대한 재정 및 직원 지원, 선전 과학 기술 혁신 위원회(Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722)의 Y. Yan에게 자금을 지원했습니다.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
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