Visualisering av proteiner med lav overflod og posttranslasjonelle modifikasjoner i levende Drosophila-embryoer via fluorescerende antistoffinjeksjon
Summary
Denne protokollen beskriver den tilpassede antistoffbaserte fluorescensmerkingen og injeksjonen i tidlige Drosophila-embryoer for å muliggjøre levende avbildning av proteiner med lav overflod eller posttranslasjonelle modifikasjoner som er utfordrende å oppdage ved bruk av tradisjonelle GFP / mCherry-tag-tilnærminger.
Abstract
Visualisering av proteiner i levende celler ved hjelp av GFP (Green Fluorescent Protein) og andre fluorescerende koder har forbedret forståelsen av proteinlokalisering, dynamikk og funksjon. Sammenlignet med immunfluorescens reflekterer levende avbildning mer nøyaktig proteinlokalisering uten potensielle artefakter som oppstår fra vevfiksering. Det er viktig at levende bildebehandling muliggjør kvantitativ og tidsmessig karakterisering av proteinnivåer og lokalisering, avgjørende for å forstå dynamiske biologiske prosesser som cellebevegelse eller deling. En stor begrensning ved fluorescerende merkingsmetoder er imidlertid behovet for tilstrekkelig høye proteinuttrykksnivåer for å oppnå vellykket visualisering. Følgelig kan mange endogent merkede fluorescerende proteiner med relativt lave uttrykksnivåer ikke påvises. På den annen side kan ektopisk uttrykk ved bruk av virale promotorer noen ganger føre til feillokalisering av protein eller funksjonelle endringer i fysiologiske sammenhenger. For å løse disse begrensningene presenteres en tilnærming som benytter svært sensitiv antistoffmediert proteindeteksjon i levende embryoer, som i hovedsak utfører immunfluorescens uten behov for vevsfiksering. Som prinsippbevis kan endogent GFP-merket Notch-reseptor som knapt kan påvises i levende embryoer, visualiseres vellykket etter antistoffinjeksjon. Videre ble denne tilnærmingen tilpasset for å visualisere posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) i levende embryoer, noe som muliggjorde påvisning av tidsmessige endringer i tyrosinfosforyleringsmønstre under tidlig embryogenese og avsløring av en ny underpopulasjon av fosfotyrosin (p-Tyr) under apikale membraner. Denne tilnærmingen kan modifiseres for å imøtekomme andre proteinspesifikke, tag-spesifikke eller PTM-spesifikke antistoffer og bør være kompatibel med andre injeksjonsvennlige modellorganismer eller cellelinjer. Denne protokollen åpner nye muligheter for levende avbildning av proteiner med lav overflod eller PTM som tidligere var utfordrende å oppdage ved hjelp av tradisjonelle fluorescerende merkingsmetoder.
Introduction
Immunfluorescens er en hjørnesteinsteknikk for moderne cellebiologi opprinnelig utviklet av Albert Coons, som muliggjør påvisning av molekyler ved deres opprinnelige cellulære rom og karakterisering av molekylære sammensetninger av subcellulære organeller eller maskiner. Sammen med genetiske manipulasjoner bidrar immunfluorescens til å etablere det nå aksepterte konseptet om at proteinlokalisering er avgjørende for dens funksjon2. Bortsett fra spesifikke primære antistoffer og lyse fluorescerende fargestoffer, er suksessen til denne teknikken avhengig av en foreløpig prosess kalt fiksering og permeabilisering, som bevarer cellulære morfologier, immobiliserer antigener og øker tilgjengeligheten av antistoffer i intracellulære rom. Uunngåelig vil fikserings- og permeabiliseringsprosessen drepe celler og avslutte alle biologiske prosesser3. Derfor gir immunfluorescens bare øyeblikksbilder av livsreisen til proteiner. Imidlertid er mange biologiske prosesser som cellemigrasjon og divisjoner dynamiske i naturen, og krever undersøkelse av proteinadferd på en romlig-temporalt løst måte 4,5.
For å undersøke proteindynamikk i levende organismer har levende bildebehandlingsmetoder basert på genetisk kodede fluorescerende proteiner som grønt fluorescerende protein (GFP) 6 og høyhastighets konfokale mikroskoper blitt utviklet. Kort fortalt kan proteinet av interesse bli genetisk manipulert for å bli smeltet sammen med GFP7, og deretter ektopisk uttrykt fra virale eller gjærpromotorer som cytomegalovirus (CMV) 8 eller oppstrøms aktiveringssekvens (UAS) 9. Fordi GFP er autofluorescerende i naturen, er det ikke nødvendig med fluoroforkoblede antistoffer for å avsløre lokaliseringen av målproteiner, som omgår nødvendigheten av foreløpige prosesser for fiksering eller permeabilisering. I løpet av de siste to tiårene har fluorescerende koder som spenner over hele spekteret av bølgelengde blitt utviklet10, noe som muliggjør flerfarget levende avbildning av flere målproteiner samtidig. Imidlertid, sammenlignet med kjemisk konstruerte fluorescerende fargestoffer som AlexaFluor eller ATTO, er autofluorescensen av disse genetisk kodede fluorescerende proteinene relativt svak og ustabil når den uttrykkes fra endogene promotorer, spesielt under levende avbildning over lengre tidsskalaer10. Selv om denne mangelen kan reduseres ved å overuttrykke fluorescerende merkede målproteiner, forstyrrer mange med enzymatiske aktiviteter som kinaser og fosfataser alvorlige normale biologiske prosesser hvis de ikke uttrykkes på fysiologiske nivåer.
Denne protokollen presenterer en metode som muliggjør fotostabil antistoffbasert målbelysning i et levende bildeoppsett, som i hovedsak tillater immunfluorescens uten fikserings- eller permeabiliseringsprosess (figur 1). Gjennom en enkel NHS-basert primær aminreaksjon11 kan man konjugere fluorescerende fargestoffer som AlexaFluor 488 eller 594 med i hovedsak et primært antistoff eller GFP / HA / Myc nanobody12. Ved å dra nytte av en utviklingsfunksjon at alle Drosophila embryonale celler deler en felles cytoplasma under syncytiumstadiet13, kan man oppnå antigenbinding og belysning over hele embryoer etter injeksjon av fargekonjugerte antistoffer. Med utvidende biblioteker av endogent merkede proteiner tilgjengelig i Drosophila og andre modellsystemer14, kan denne metoden potensielt utvide anvendelser av disse bibliotekene ved å avsløre dynamikken i fluorescerende merkede proteiner med lav overflod og andre ikke-fluorescerende merkede (HA / Myc-merkede) proteiner i levende vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne presenterte prosedyren skisserer den spesialiserte metoden for fluorescensmerking med tilpassede antistoffer og påfølgende injeksjon i Drosophila-embryoer i tidlig stadium. Denne teknikken muliggjør sanntidsvisualisering av proteiner eller posttranslasjonelle modifikasjoner som eksisterer i lave mengder og er vanligvis vanskelige å observere gjennom konvensjonelle GFP / mCherry-merkingsmetoder.
Forsiktighet bør utvises ved utvidelse av denne metoden for å gjøre kvantitati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Dr. Jennifer A. Zallen for å gi Sqh-GFP Drosophila-linjen og støtte til den første utviklingen av denne teknikken, og Dr. Francois Schweisguth for å gi Notch-GFP Drosophila-linjen . Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra National Natural Science Foundation of China (32270809) til HH Yu, sjenerøs økonomisk og personalstøtte fra School of Life Sciences, SUSTech, og finansiering til Y. Yan fra Shenzhen Science and Technology Innovation Commission / JCYJ20200109140201722.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
- Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
- Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. Biobanking, methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. The Notch-mediated proliferation circuitry. Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. Monoclonal antibodies to phosphotyrosine. Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
