Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes
Summary
Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.
Abstract
A visualização de proteínas em células vivas usando GFP (Green Fluorescent Protein) e outras etiquetas fluorescentes melhorou muito a compreensão da localização, dinâmica e função de proteínas. Em comparação com a imunofluorescência, a imagem viva reflete com mais precisão a localização de proteínas sem potenciais artefatos decorrentes da fixação tecidual. É importante ressaltar que imagens ao vivo permitem a caracterização quantitativa e temporal dos níveis e localização de proteínas, cruciais para a compreensão de processos biológicos dinâmicos, como movimento ou divisão celular. No entanto, uma das principais limitações das abordagens de marcação fluorescente é a necessidade de níveis de expressão proteica suficientemente altos para alcançar uma visualização bem-sucedida. Consequentemente, muitas proteínas fluorescentes marcadas endogenamente com níveis de expressão relativamente baixos não podem ser detectadas. Por outro lado, a expressão ectópica usando promotores virais pode, por vezes, levar à má localização de proteínas ou alterações funcionais em contextos fisiológicos. Para abordar essas limitações, é apresentada uma abordagem que utiliza a detecção de proteínas mediadas por anticorpos altamente sensíveis em embriões vivos, essencialmente realizando imunofluorescência sem a necessidade de fixação tecidual. Como prova de princípio, o receptor Notch marcado com GFP endogenamente que é pouco detectável em embriões vivos pode ser visualizado com sucesso após a injeção de anticorpos. Além disso, essa abordagem foi adaptada para visualizar modificações pós-traducionais (MPTs) em embriões vivos, permitindo a detecção de mudanças temporais nos padrões de fosforilação da tirosina durante o início da embriogênese e revelando uma nova subpopulação de fosfotirosina (p-Tyr) sob membranas apicais. Essa abordagem pode ser modificada para acomodar outros anticorpos específicos para proteínas, específicos para tags ou específicos para PTM e deve ser compatível com outros organismos modelo ou linhagens celulares passíveis de injeção. Este protocolo abre novas possibilidades para imagens ao vivo de proteínas de baixa abundância ou PTMs que anteriormente eram difíceis de detectar usando métodos tradicionais de marcação fluorescente.
Introduction
A imunofluorescência é uma técnica fundamental da biologia celular moderna originalmente desenvolvida por Albert Coons, que permite a detecção de moléculas em seus compartimentos celulares nativos e a caracterização das composições moleculares de organelas ou máquinassubcelulares1. Aliada às manipulações genéticas, a imunofluorescência ajuda a estabelecer o conceito hoje bem aceito de que a localização de proteínas é essencial para sua função2. Além de anticorpos primários específicos e corantes fluorescentes brilhantes, o sucesso dessa técnica depende de um processo preliminar denominado fixação e permeabilização, que preserva morfologias celulares, imobiliza antígenos e aumenta a acessibilidade dos anticorpos nos compartimentos intracelulares. Inevitavelmente, o processo de fixação e permeabilização mataria as células e encerraria todos os processos biológicos3. Portanto, a imunofluorescência fornece apenas instantâneos da jornada de vida das proteínas. Entretanto, muitos processos biológicos, como migração e divisão celular, são de natureza dinâmica, exigindo investigação do comportamento proteico de forma espacial-temporalmente resolvida 4,5.
Para examinar a dinâmica de proteínas em organismos vivos, métodos de imagem vivos baseados em proteínas fluorescentes codificadas geneticamente, como a proteína fluorescente verde (GFP)6 e microscópios confocais de alta velocidade, foram desenvolvidos. Resumidamente, a proteína de interesse pode ser geneticamente manipulada para ser fundida com GFP7 e, em seguida, expressa ectopicamente a partir de promotores virais ou de leveduras, como citomegalovírus (CMV)8 ou sequência de ativação a montante (UAS)9. Como a GFP é de natureza autofluorescente, não são necessários anticorpos acoplados a fluoróforos para revelar a localização das proteínas-alvo, o que ignora a necessidade de processos preliminares de fixação ou permeabilização. Nas últimas duas décadas, etiquetas fluorescentes abrangendo todo o espectro de comprimento de onda foram desenvolvidas10, permitindo imagens ao vivo multicoloridas de várias proteínas-alvo ao mesmo tempo. No entanto, em comparação com corantes fluorescentes quimicamente modificados, como AlexaFluor ou ATTO, a autofluorescência dessas proteínas fluorescentes codificadas geneticamente é relativamente fraca e instável quando expressa a partir de promotores endógenos, especialmente durante imagens ao vivo em escalas de tempo mais longas10. Embora essa deficiência possa ser atenuada pela superexpressão de proteínas-alvo marcadas fluorescentemente, muitas com atividades enzimáticas, como quinases e fosfatases, interrompem severamente os processos biológicos normais se não forem expressas em níveis fisiológicos.
Este protocolo apresenta um método que permite a iluminação do alvo fotoestável baseada em anticorpos em uma configuração de imagem ao vivo, permitindo essencialmente a imunofluorescência sem o processo de fixação ou permeabilização (Figura 1). Através de uma reação de amina primária simples baseada no NHS11, pode-se conjugar corantes fluorescentes como AlexaFluor 488 ou 594 com essencialmente qualquer anticorpo primário ou nanocorpo GFP/HA/Myc12. Aproveitando uma característica de desenvolvimento de que todas as células embrionárias de Drosophila compartilham um citoplasma comum durante o estágio de sincício13, pode-se obter ligação e iluminação antigênica em embriões inteiros após a injeção de anticorpos conjugados com corante. Com a expansão de bibliotecas de proteínas marcadas endogenamente disponíveis em Drosophila e outros sistemas modelo14, este método pode potencialmente ampliar as aplicações dessas bibliotecas revelando a dinâmica de proteínas marcadas fluorescentemente de baixa abundância e outras proteínas marcadas não fluorescentemente (HA/Myc-tagged) em tecidos vivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimento apresentado descreve o método especializado de marcação por fluorescência com anticorpos personalizados e subsequente injeção em embriões de Drosophila em estágio inicial. Esta técnica facilita a visualização em tempo real de proteínas ou modificações pós-traducionais que existem em baixas quantidades e são tipicamente difíceis de observar através de métodos convencionais de marcação GFP/mCherry.
Deve-se ter cautela ao estender esse método para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à Dra. Jennifer A. Zallen por fornecer a linha Sqh-GFP Drosophila e apoio para o desenvolvimento inicial desta técnica, e ao Dr. François Schweisguth por fornecer a linha Notch-GFP Drosophila . Este trabalho foi apoiado por financiamento da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32270809) para H.H.Yu, generoso apoio financeiro e pessoal da Escola de Ciências da Vida, SUSTech, e financiamento para Y. Yan da Comissão de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen/JCYJ20200109140201722.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
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