يصف هذا البروتوكول منصة زراعة الخلايا القائمة على الغشاء القابلة لإعادة التكوين والتي تدمج تنسيق البئر المفتوح مع قدرات تدفق السوائل. تتوافق هذه المنصة مع البروتوكولات القياسية وتسمح بالانتقال القابل للانعكاس بين أوضاع زراعة البئر المفتوحة والمستنبتات الدقيقة ، مما يلبي احتياجات كل من مختبرات الهندسة والعلوم البيولوجية.
الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة هي منصات مصغرة لزراعة الخلايا تستخدم لتقليد بنية ووظيفة الأنسجة البشرية في بيئة المختبر. ومع ذلك ، لم تكتسب هذه المنصات اعتمادا واسع النطاق في مختبرات العلوم البيولوجية حيث تعمل الأساليب القائمة على الأغشية المفتوحة كمعيار ذهبي لمحاكاة حواجز الأنسجة ، على الرغم من افتقارها إلى قدرات تدفق السوائل. يمكن أن تعزى هذه المشكلة في المقام الأول إلى عدم توافق الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة الحالية مع البروتوكولات والأدوات القياسية المطورة لأنظمة الآبار المفتوحة.
هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء منصة قائمة على الغشاء قابلة لإعادة التشكيل مع هيكل بئر مفتوح ، وقدرة على تحسين التدفق ، والتوافق مع البروتوكولات التقليدية. يستخدم هذا النظام نهج التجميع المغناطيسي الذي يتيح التبديل العكسي بين أوضاع البئر المفتوحة وأوضاع الموائع الدقيقة. باستخدام هذا النهج ، يتمتع المستخدمون بالمرونة لبدء تجربة بتنسيق البئر المفتوح باستخدام البروتوكولات القياسية وإضافة أو إزالة إمكانات التدفق حسب الحاجة. لإثبات الاستخدام العملي لهذا النظام وتوافقه مع التقنيات القياسية ، تم إنشاء طبقة أحادية الخلية البطانية في شكل بئر مفتوح. تمت إعادة تشكيل النظام لإدخال تدفق السوائل ثم تم تحويله إلى تنسيق البئر المفتوح لإجراء تلطيخ المناعة واستخراج الحمض النووي الريبي. نظرا لتوافقه مع بروتوكولات الآبار المفتوحة التقليدية وقدرة تحسين التدفق ، من المتوقع أن يتم اعتماد هذا التصميم القابل لإعادة التكوين من قبل كل من مختبرات الهندسة والعلوم البيولوجية.
تعمل الحواجز الوعائية كواجهة مهمة تفصل حجرة الدم عن الأنسجة المحيطة. إنها تلعب دورا مهما في الحفاظ على التوازن من خلال جذب الخلايا المناعية ، والتحكم في النفاذية الجزيئية ، والحماية من تسلل مسببات الأمراض إلى الأنسجة 1,2. تم تطوير نماذج الاستزراع في المختبر لمحاكاة البيئة المكروية في الجسم الحي ، مما يتيح إجراء تحقيقات منهجية في العوامل والظروف التي تؤثر على خصائص الحاجز في كل من الحالات الصحية والمريضة 3,4.
النهج الأكثر استخداما لنماذج الاستزراع هذه هو تكوين “البئر المفتوح”الشبيه ب Transwell 5 ، حيث يفصل غشاء استزراع مسامي محفور في المسار المقصورات المملوءة بالوسائط (الشكل 1 أ). في هذا الشكل ، يمكن زرع الخلايا على جانبي الغشاء ، وقد تم تطوير مجموعة واسعة من البروتوكولات التجريبية. ومع ذلك ، فإن هذه الأنظمة محدودة في قدرتها على توفير تدفقات السوائل الضرورية لدعم نضوج الحاجز ومحاكاة الدورة الدموية للخلايا المناعية التي تظهر في الجسم الحي 5,6. وبالتالي ، لا يمكن استخدامها للدراسات التي تتطلب تدفقات ديناميكية تقدم جرعات دوائية أو تحفيزا ميكانيكيا أو إجهادات قص ناتجة عن السوائل6،7،8.
للتغلب على قيود أنظمة الآبار المفتوحة ، تم تطوير منصات الموائع الدقيقة التي تجمع بين أغشية الاستزراع المسامية والقنوات السائلة القابلة للعنونة بشكل فردي9. توفر هذه المنصات تحكما دقيقا في توجيه السوائل ، والتروية ، وإدخال المركبات الكيميائية ، وتحفيز القص المتحكم فيه ، وقدرات إضافة الخلاياالديناميكية 7،10،11،12،13. على الرغم من القدرات المتقدمة التي توفرها منصات الموائع الدقيقة ، إلا أنها لم تشهد اعتمادا واسع النطاق في مختبرات العلوم البيولوجية بسبب بروتوكولات الموائع الدقيقة المعقدة وعدم توافقها مع سير العمل التجريبي المعمول به4،10،14.
لسد الفجوة بين هذه التقنيات ، نقدم بروتوكولا يستخدم نظاما قابلا لإعادة التكوين مغناطيسيا وقائما على الوحدة. يمكن تبديل هذا النظام بسهولة بين أوضاع البئر المفتوح وأوضاع الموائع الدقيقة بناء على الاحتياجات المحددة للتجربة. تتميز المنصة بجهاز بئر مفتوح ، يعرف باسم m-μSiM (نظام فسيولوجي دقيق معياري يتم تمكينه بواسطة غشاء سيليكون) ، مع غشاء استزراع بسمك 100 نانومتر (غشاء نانوي). يمتلك هذا الغشاء النانوي مسامية عالية (15٪) وشفافية تشبه الزجاج ، كما هو موضح في الشكل 1B. إنه يفصل فعليا الجزء العلوي عن القناة السفلية ، مما يسمح بالنقل الجزيئي عبر مقاييس الطول الفسيولوجية15. على عكس الأغشية التقليدية المحفورة بالمسار ، والتي عرفت تحديات في تصوير الخلايا الحية بتصوير المجال الساطع ، تتيح الخصائص البصرية والفيزيائية المواتية للغشاء النانوي تصورا واضحا للخلايا على جانبي سطح الغشاء15،16،17.
يحدد هذا البروتوكول تصنيع وحدات البذر والتدفق المتخصصة ويشرح إعادة التكوين المغناطيسي للمنصة. يوضح كيف يمكن استخدام المنصة لإنشاء حواجز بطانية في ظل ظروف ثابتة وديناميكية. يكشف هذا العرض التوضيحي أن الخلايا البطانية تصطف على طول اتجاه التدفق ، مع تنظيم أهداف الجينات الحساسة للقص تحت تحفيز القص.
الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير طريقة عملية لدمج قدرات التدفق في منصة بئر مفتوحة تتميز بغشاء نانوي فائق النحافة. في هذا التصميم ، يتم استخدام نهج الإغلاق المغناطيسي ، مما يسمح بالتبديل بين أوضاع البئر المفتوحة والسائلة أثناء التجارب والجمع بين مزايا كلا النهجين. على عكس المنصات التقليدي…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل المعهد الوطني للصحة تحت أرقام الجوائز R43GM137651 و R61HL154249 و R16GM146687 و NSF منحة CBET 2150798. يشكر المؤلفون RIT Machine Shop لتصنيع قوالب الألومنيوم. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |