위 환자 유래 오가노이드는 연구에서 점점 더 많이 사용되고 있지만, 표준화된 파종 밀도를 가진 단일 세포 분해물에서 인간 위 오가노이드를 생성하기 위한 공식적인 프로토콜은 부족합니다. 이 프로토콜은 상부 내시경 검사 중에 얻은 생검 조직에서 위 오가노이드를 안정적으로 생성하는 자세한 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
위 환자 유래 오가노이드(PDO)는 위 생물학 및 병리학을 연구하기 위한 고유한 도구를 제공합니다. 결과적으로 이러한 PDO는 다양한 연구 응용 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 표준화된 초기 세포 파종 밀도를 유지하면서 단일 세포 분해물에서 위 PDO를 생산하기 위한 공개된 접근법이 부족합니다. 이 프로토콜에서는 분리된 단일 세포에서 위 오가노이드를 시작하고 단편화를 통해 오가노이드를 통과시키는 방법을 제공하는 데 중점을 둡니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 초기 세포 파종 밀도에 대한 표준화된 접근 방식이 양성 생검 조직에서 일관되게 위 오가노이드를 생성하고 오가노이드 성장의 표준화된 정량화를 가능하게 한다는 것을 보여줍니다. 마지막으로, 증거는 위 PDO가 오가노이드가 신체의 생검에서 유래했는지 또는 위의 전방 영역에서 유래했는지에 따라 다양한 형성 및 성장 속도를 나타낸다는 새로운 관찰을 뒷받침합니다. 특히, 오가노이드 개시를 위해 전방 생검 조직을 사용하면 위체의 생검에서 생성된 오가노이드와 비교할 때 20일 동안 더 많은 수의 오가노이드가 형성되고 더 빠른 오가노이드 성장이 발생하는 것으로 나타났습니다. 본 명세서에 기술된 프로토콜은 연구자에게 위 PDO를 성공적으로 생성하고 작업하기 위한 시기적절하고 재현 가능한 방법을 제공한다.
서론
오가노이드는 1,2에서 파생된 장기의 구조와 기능을 닮은 소형 3차원(3D) 세포 구조입니다. 이러한 실험실 성장 모델은 줄기 세포 또는 조직 특이적 세포를 통제된 환경에서 배양하여 생성되며, 이를 통해 세포가 다양한 세포 유형으로 자체 조직화되고 분화할 수 있습니다 1,2,3. 오가노이드의 주요 장점 중 하나는 기존의 2차원(2D) 세포 배양보다 인간 생물학을 더 면밀히 재현할 수 있다는 것입니다 1,2,3. 특히, 인간 오가노이드는 기원 조직의 유전적 다양성을 유지하는 것으로 나타났습니다 3,4,5. 오가노이드는 통제된 실험실 환경에서 인간 장기 발달을 연구하고, 질병을 모델링하고, 잠재적인 치료법을 테스트할 수 있는 고유한 기회를 제공합니다. 또한 오가노이드는 개별 환자 샘플에서 파생될 수 있으므로 맞춤형 의학 접근법과 개별화된 치료법의 잠재적 개발이 가능합니다 3,6,7.
연구원들은 인간 위 오가노이드를 사용하여 위 생물학 및 병리학의 다양한 측면을 조사했습니다. 대표적인 예로는 환자 유래 오가노이드(PDO)를 사용하여 위암 화학요법 반응을 예측하고8,9,10 헬 리코박터 파일로리 감염에 대한 상피 반응을 모델링하는 것을 들 수 있다 11,12,13. 인간 위 오가노이드는 목 세포, 구덩이 세포 및 기타 지원 세포를 포함하여 위에서 발견되는 다양한 세포 유형으로 구성됩니다11,14. 위 오가노이드는 유도만능줄기세포(iPSC) 또는 생검을 통해 얻은 위 조직으로부터 직접 분리된 줄기세포나 위 절제술 표본으로부터 생성될 수 있다11,14. 위 조직으로부터 위 줄기 세포를 분리하는 것은 일반적으로 위선을 분리 및 배양하거나 단일 세포를 방출하기 위해 조직 샘플을 효소로 소화함으로써 수행된다 9,13,15. 중요한 것은 이러한 기술 중 하나를 사용하여 생성된 위 오가노이드 내 세포의 분화가 유사한 것으로 나타났다는 것입니다13. 본원에 기술된 프로토콜은 단일-세포 분해에 초점을 맞춘다.
오가노이드는 전통적인 세포 배양과 전체 장기 사이의 격차를 해소하는 과학적 혁신을 나타냅니다. 이 분야의 연구가 계속 진행됨에 따라 오가노이드는 광범위한 응용 분야에서 보다 효과적인 치료법 및 치료법 개발에 기여할 준비가 되어 있습니다. 위 PDO의 활용도가 높아짐에 따라 PDO 생성에 대한 표준화된 접근 방식이 시의적절하게 필요합니다. 여기에서, 상부 내시경 동안 획득된 양성 위 생검 조직으로부터 분리된 단일 세포로부터 인간 위 PDO를 생성하기 위한 프로토콜이 설명된다. 중요하고 독특하게도, 위 PDO를 안정적으로 생성하고 후속 특성 분석을 허용하기 위해 파종에 대해 표준화된 수의 단일 세포가 결정됩니다. 이 기술을 사용하여 위체 또는 위 안반의 생검에서 생성된 오가노이드의 형성 및 성장에 대한 신뢰할 수 있는 차이를 입증합니다.
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프로토콜
이 프로토콜에 사용된 모든 인체 조직은 펜실베니아 대학교 기관 검토 위원회(IRB #842961)에서 승인한 위 조직 수집 연구를 통해 조직 수집에 대한 정보에 입각한 동의를 제공한 개인으로부터 수집되었습니다. 이 연구의 참가자는 일상적인 치료의 일환으로 상부 내시경 검사를 받아야 하고 18세 이상이어야 하며 정보에 입각한 동의를 제공할 수 있어야 했습니다. 수행된 모든 연구는 펜실베니아 대학교에서 정한 지침을 준수했습니다.
1. 실험 준비
- 앞서 설명한 대로 컨디셔닝된 L-WRN 매체를 준비합니다16. 필수는 아니지만 컨디셔닝된 배지에 포함된 Wnt-3A, R-spondin 및 noggin의 농도는 제조업체의 지침에 따라 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 확인할 수 있습니다( 재료 표 참조).
- RPMI-항생제(RPMI-ABX), PBS-항생제(PBS-ABX), PBS-디티오트레이톨(PBS-DTT), 분해 완충액 및 위 오가노이드 배지를 준비합니다(세부 조성은 보충 표 1 참조). 위 오가노이드 배지는 4°C에서 1주일 동안 안정적입니다.
- 오토클레이브 겸자, 미세 해부 가위 및 1.5mL 튜브.
- 얼음 위에서 기저막 매트릭스(Matrigel)를 해동하기 시작합니다.
- 37°C 수조에서 분해 완충액과 Trypsin-EDTA를 해동하기 시작합니다.
- 인큐베이터 오비탈 셰이커를 37°C 및 200rpm으로 설정합니다.
2. 생검 조직에서 단일 세포 분리
- 점보 겸자의 사용이 포함될 수 있는 기관 임상 프로토콜에 따라 상부 내시경검사 17 중에 위 생검을 수집합니다. 끝이 뭉툭한 바늘을 사용하여 겸자에서 조직 샘플을 추출하고 RPMI-ABX 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 실험실로 빠르게 이송할 수 있도록 튜브를 얼음 위에 두십시오.
알림: 최소 2-4회의 생검을 받아야 합니다. - 생검 조직이 원뿔형 튜브의 바닥에 가라앉도록 합니다. 피펫을 사용하여 배지를 흡인하고 PBS-ABX 완충액 1mL로 생검을 두 번 세척합니다. 조직 조각이 원추형 튜브에 자연적으로 침전되기 때문에 원심분리가 필요하지 않습니다.
- 최소 20mg의 생검 조직을 1mL의 PBS-DTT가 들어 있는 1.5mL 튜브에 옮깁니다.
- 미세한 해부 가위를 사용하여 조직을 1-2mm 이하로 자릅니다.
- 탁상용 미니 원심분리기를 15초 동안 사용하여 튜브 바닥에서 조직 조각을 응집하고 가능한 한 많은 상층액을 흡인합니다. PBS-DTT의 작은 잔류 부피가 허용됩니다.
- 50mL 코니컬 튜브에 갓 데운 분해 완충액 5mL를 추가합니다. 조직을 잃지 않고 작은 조직 조각을 옮기려면 500μL의 분해 완충액을 조직이 들어 있는 1.5mL 튜브에 추가합니다. 다음으로, 1000 μL 피펫 팁의 팁을 가위로 수정하여 팁의 직경을 늘려 조직 조각을 쉽게 흡인하고 분해 완충액이 들어 있는 50 mL 코니컬 튜브로 옮길 수 있도록 합니다.
- 분해 완충액과 조직 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양하고 200rpm에서 궤도를 흔듭니다.
- 0.25% EDTA가 함유된 따뜻하게 데운 트립신 5mL를 분해 완충액에 넣고 200rpm에서 궤도 쉐이킹을 하면서 37°C에서 10분 더 배양합니다.
- 동일한 부피의 고급(고급) DMEM/F12 배지를 추가하여 분해 완충액과 트립신을 중화하고 용액을 70μm 세포 여과기에 통과시킵니다.
- 4°C에서 4분 동안 1400 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 생검 조직의 초기 크기에 따라 작은 세포 펠릿이 보일 수도 있고 보이지 않을 수도 있습니다.
- 세포 펠릿을 Adv. DMEM/F12 배지 1mL에 재현탁시키고 Trypan Blue와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.
- 4°C에서 4분 동안 1400 x g 에서 원심분리를 통해 세포를 다시 펠트하고 상층액을 제거합니다.
참고: 그림 1 은 생검 조직에서 단일 세포를 분리하는 과정을 개략적으로 나타낸 것입니다.
3. 기저막 매트릭스 "돔"에 단일 세포 내장
- 계수된 생존 가능한 세포 수를 기반으로 기저막 매트릭스 50μL당 105 개의 생존 가능한 세포의 최종 농도를 달성하는 데 필요한 기저막 매트릭스의 부피를 계산합니다.
- 도금 전에 기저막 매트릭스가 중합되는 것을 방지하기 위해 다음을 신속하게 수행하십시오. 얼음에서 해동된 기저막 매트릭스를 제거하고, 이전에 계산한 기저막 매트릭스 부피를 셀에 추가하고, 약 10초 동안 피펫팅을 위아래로 하여 부드럽게 혼합합니다.
참고: 이 단계에서 거품이 생기지 않도록 하는 것이 중요합니다. 기저막 매트릭스를 희석하지 마십시오. - 기저막 매트릭스/세포 혼합물의 50μL 분취액을 24웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰 중앙으로 빠르게 피펫팅합니다.
- 즉시 24웰 플레이트를 덮고 한 번의 부드러운 동작으로 플레이트를 거꾸로 뒤집습니다. 거꾸로 된 플레이트를 37°C 조직 배양 인큐베이터에 35분 동안 넣어 기저막 매트릭스가 중합되도록 합니다.
참고: 플레이트를 뒤집는 것은 셀이 플레이트 바닥으로 가라앉는 것을 방지하고 기저막 매트릭스가 3D "돔" 모양으로 중합될 수 있도록 하는 데 필수적입니다. - 500μL의 예열된 위 오가노이드 배지를 각 웰에 추가하여 각 "돔"의 상단이 배지에 완전히 잠기도록 합니다. "돔"을 방해하지 않도록 각 웰의 측면에 미디어를 분배합니다.
- 2-3일마다 미디어를 교체하십시오.
4. 단편화를 통한 오가노이드의 일상적인 패시징
- 오가노이드가 통과할 준비가 되면 지정된 각 웰에서 배지를 제거합니다.
참고: 적절한 통과 시간을 결정하려면 대표 결과 섹션을 참조하십시오. - 얼음처럼 차가운 Adv. DMEM/F12 배지 1mL를 기저막 매트릭스 "돔"에 직접 분주합니다. 이것은 "돔"의 해체를 쉽게 시작할 것입니다. "돔"의 모든 조각이 플레이트에서 분리될 때까지 계속 흡입 및 분배합니다.
- 매체와 조각난 기저막 매트릭스를 모두 다음 우물로 운반하고 통과 예정인 모든 우물에 대해 이 과정을 반복합니다. 최종 기저막 매트릭스 "돔"을 분해한 후 배지와 오가노이드 및 기저막 매트릭스의 혼합물을 1.5mL 튜브에 디스펜싱합니다.
- 1000 μL 팁을 P1000 피펫에 부착한 다음 이 팁을 200 μL 팁에 삽입합니다. 이렇게 하면 오가노이드를 조각화할 수 있을 만큼 충분히 작은 직경의 피펫 팁이 생성되는 동시에 더 큰 부피를 흡인할 수 있습니다.
- 오가노이드와 기저막 매트릭스의 혼합물을 위아래로 약 25회 세게 피펫팅하여 오가노이드를 작은 조각으로 조각화합니다.
- 4°C에서 탁상용 원심분리기를 사용하여 2000 x g에서 30초 동안 조각난 오가노이드 혼합물을 원심분리합니다. 이로 인해 기저막 매트릭스 및 배지에서 분리된 단편화된 오가노이드 펠릿이 생성됩니다. 피펫을 사용하여 배지와 기저막 매트릭스 상층액을 흡입합니다. 펠릿이 느슨하므로 상층액을 흡입하기 위해 진공 청소기를 사용하지 마십시오.
- 웰/돔의 수가 1:2 비율(50μL/돔)로 분할되도록 필요한 갓 해동된 기저막 매트릭스의 부피를 계산합니다. 신선한 기저막 매트릭스를 추가하고 기포가 생기지 않도록 주의하면서 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
- 오가노이드 단편과 기저막 매트릭스의 혼합물 50μL를 24웰 플레이트의 개별 웰에 신속하게 분주합니다.
- 플레이트를 덮고 거꾸로 뒤집은 다음 37°C 조직 배양 인큐베이터에 35분 동안 넣어 기저막 매트릭스가 중합되도록 합니다.
- 예열된 위 오가노이드 배지 500μL를 각 웰에 추가합니다.
참고: 그림 2 는 단편화를 통한 위 환자 유래 오가노이드의 패시에이징에 대한 개략적인 개요를 보여줍니다.
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결과
후속 대표 결과는 상부 내시경 검사를 받는 5명의 다른 환자의 위와 위 안방 부위의 양성 상피에서 채취한 생검에서 도출되었습니다. 2 내지 4개의 "돔"/웰을 도금하여 위체 및 전방 생검 모두에 대해 환자당 분석하였다. 오가노이드는 5명의 환자 모두의 위체와 위 전방 생검 조직에서 성공적으로 생성되었습니다. 평균적으로 "돔"/웰당 41개의 오가노이드가 분석되었습니다. 모든 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 획득한 z-투영이며, 오가노이드 크기 및 구형도의 정량화는 시판되는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다( 재료 표 참조).
오가노이드는 일반적으로 단일 세포의 파종 후 10일 이내에 식별할 수 있습니다(그림 3A). 20일째가 되면 오가노이드가 커지고 일반적으로 통과해야 합니다. 단세포 시딩 후 형성되는 오가노이드의 수는 다소 가변적일 수 있지만, 체내 및 전방 위 생검에서 형성된 ...
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토론
여기에서, 위체 및 antrum의 양성 상피의 생검으로부터 분리된 단일 세포로부터 인간 위 오가노이드를 신뢰성 있게 생성하기 위한 상세한 프로토콜이 개략적으로 설명된다. 프로토콜의 중요한 단계는 타이밍과 기저 멤브레인 매트릭스 처리와 관련이 있습니다. 생존력을 보존하려면 생검 조직을 획득한 후 가능한 한 빨리 프로토콜을 시작하는 것이 중요합니다. 목표는 생검 후 30분 이내에 생검 조직을 소화하기 시작하는 것입니다. 기저막 매트릭스를 다루는 것도 어려울 수 있습니다. 얼음 위에서 해동하면 액체로 남습니다. 그러나 4°C 이상의 온도에서는 중합됩니다. 따라서 기저막 매트릭스를 얼음에서 신속하게 옮겨 "돔"을 도금하기 위해 단일 세포 또는 오가노이드 조각과 혼합하는 것은 1분 이내에 중합을 시작하므로 즉시 수행되어야 합니다. 튜브에서 중합되면 피펫 팁으로 흡입할 수 없습니다. 이 경우 Matrigel이 액체로 다시 해중합될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓을 수 있습니다. 단일 세포 또는 오가노이드 단편을 기저막 기질과 혼합하기 위해 위...
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공개 사항
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감사의 글
펜실베니아 대학교 게놈 의학 T32 HG009495(KHB), NCI R21 CA267949(BWK), BRCA Basser Center for BRCA의 남성 및 BRCA 프로그램(KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award(BWK).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R& D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| 암포테리신 B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | 해당 없음 | |
| cellSens | Olympus | 해당 없음 | |
| 콜라겐분해효소 III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN 세포주 | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 보충제 | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA 키트 | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| 펜 연쇄상 구균 | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA 키트 | R& D 시스템 | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA 키트 | R& D 시스템 | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | 시그마 알드리치 | Y0503 |
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