여기에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 직접 관찰하고 자동으로 측정하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 휴대용 기공 영상 장치와 장치에서 캡처한 잎 이미지를 위해 설계된 이미지 분석 파이프라인을 활용합니다.
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방법 논문
Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
기공은 식물 잎 표피에서 발견되는 미세한 구멍입니다. 기공 구멍의 조절은 광합성을 위한 이산화탄소 흡수와 증열 수분 손실의 균형을 맞출 뿐만 아니라 박테리아 침입을 제한하는 데에도 중추적인 역할을 합니다. 식물은 미생물을 인식하면 기공을 닫는 반면, 슈도모나스 주사기와 같은 병원성 박테리아는 pv. 토마토 DC3000 (Pto), 닫힌 기공을 다시 열어 잎 내부로 접근합니다. 세균 침입에 대한 기공 반응을 평가하기 위한 기존 분석법에서는 잎 표피 껍질, 잎 디스크 또는 분리된 잎을 박테리아 현탁액에 띄운 다음 현미경으로 기공을 관찰한 후 기공 구멍을 수동으로 측정합니다. 그러나 이러한 분석은 번거롭고 식물에 부착된 잎의 자연적인 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 반영하지 않을 수 있습니다. 최근에는 잎을 식물에서 떼어내지 않고 꼬집어 기공을 관찰할 수 있는 휴대용 영상 장치와 함께 기기로 촬영한 잎 이미지에서 기공 개구를 자동으로 측정하도록 설계된 딥러닝 기반 이미지 분석 파이프라인이 개발되었습니다. 여기에서 이러한 기술적 진보를 바탕으로 애기장대(Arabidopsis thaliana )의 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 평가하는 새로운 방법이 소개되었습니다. 이 방법은 자연 감염 과정을 모방한 Pto 분무 접종, 휴대용 이미징 장치를 사용하여 Pto 접종 식물의 잎에 있는 기공을 직접 관찰하는 방법, 이미지 분석 파이프라인에 의한 기공 개구의 자동 측정의 세 가지 간단한 단계로 구성됩니다. 이 방법은 자연적인 식물-박테리아 상호 작용을 밀접하게 모방하는 조건에서 Pto 침입 중 기공 폐쇄 및 재개를 입증하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
서론
기공은 식물의 잎 표면과 다른 공중 부분에 있는 한 쌍의 보호 세포로 둘러싸인 미세한 구멍입니다. 끊임없이 변화하는 환경에서 기공 구멍의 조절은 식물이 증산을 통한 수분 손실을 희생하면서 광합성에 필요한 이산화탄소 흡수를 제어하는 데 중요합니다. 따라서 기공 구멍의 정량화는 식물 환경 적응을 이해하는 데 중요한 역할을 했습니다. 그러나 기공 조리개를 정량화하는 것은 현미경으로 캡처한 잎 이미지에서 기공 기공을 발견하고 측정하기 위해 사람의 노동이 필요하기 때문에 본질적으로 시간이 많이 걸리고 번거롭습니다. 이러한 한계를 피하기 위해, 기공 생물학 1,2,3,4,5,6을 연구하는 데 광범위하게 사용되는 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 기공 구멍의 정량화를 용이하게 하기 위한 다양한 방법이 개발되었습니다. 예를 들어, 기공 전도도의 척도로 증산 속도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이 방....
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프로토콜
1. 식물 재배
- 휴면을 깨기 위해 A. thaliana (Col-0) 씨앗을 탈이온수에 재현탁시키고 어둠 속에서 4일 동안 4°C에서 배양합니다.
- 토양에 씨앗을 뿌리고 흰색 형광등이 장착 된 방에서 자랍니다. 22°C의 온도, 10시간 동안 6,000lux(약 100μmol/m2/s)의 광도, 60%의 상대 습도를 유지합니다.
- 필요한 경우 액체 비료로 식물에 물을 줍니다. 접종 1 주일 전부터 2 일 전까지는 급수를 삼가하고 접종 1 일 전에는 우물물을 주세요.
2. 세균 접종 준비
- 50μg/mL 리팜피신으로 고형화된 King's B(KB) 배지(트립톤 20g, K2HPO 4 1.5g, 1L용 글리세롤 15g, 1.5% 한천)의 글리세롤 스톡에서 Pto를 줄무늬 Pto하고 28°C에서 2일 동안 배양합니다.
- 50μg/mL 리팜피신을 5mL의 KB 액체 배지에 단일 콜로니를 접종하고 28°C에서 200rpm에서 진탕하여 후기 로그 성장 단계까지 배양합니다.
- 배양액을 6,000 x....
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결과
Pto의 분무 접종 후, 접종한 식물에 부착된 잎의 기공을 휴대용 기공 영상 장치로 직접 관찰했습니다. 수동 및 자동 측정을 사용하여 동일한 잎 이미지를 사용하여 약 60개의 기공의 너비와 길이의 비율을 취하여 기공 구멍을 계산했습니다. 수동 및 자동 측정은 접종 후 1시간(hpi)에 모의 접종된 식물과 비교하여 Pto 접종 식물의 기공 구멍이 감소한 것으로 일관되게 나타났으며(그림 3A,B), 이는 A thaliana 식물이 Pto 침입에 반응하여 기공을 닫는다는 것을 나타냅니다. 3 hpi에서, Pto를 접종한 식물과 모의 접종을 한 식물의 기공 구멍은 거의 동일했으며(그림 3C,D), Pto에 의한 기공 재개를 연상시킵니다. 놀랍게도, 기공 조리개의 자동 측정은 .......
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토론
이전 연구에서는 세균 침입에 대한 기공 반응을 조사하기 위해 표피 껍질, 잎 디스크 또는 분리된 잎을 사용했다 9,11,12. 대조적으로, 본 연구에서 제안된 방법은 휴대용 기공 영상 장치를 활용하여 Pto를 분무 접종한 후 식물에 부착된 잎의 기공을 직접 관찰하여 박테리아 침입의 자연 조건을 모방합니다. 또한 이 방법은 잎 분리, 잎 디스크 절제 및 표피 박리와 같은 파괴적인 샘플 준비 프로세스를 포함하지 않기 때문에 이러한 샘플 준비 프로세스와 관련된 상처 및 수분 손실을 방지할 수 있습니다. 상처와 수분 손실은 필연적으로 기공 운동에 영향을 미치는 식물 호르몬인 자스모네이트(jasmonate)와 아브시스산(abscisic acid)과 같은 식물 유래 신호를 생성하기 때문에 이러한 효과를 가볍게 여겨서는 안 된다.......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
유익한 토론을 해주신 '식물-미생물 홀로비온트 조립을 통한 식물 적응 형질의 공동 창조'라는 연구 프로젝트의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 Grant-in-Aid for Transformative Research Areas(21H05151 및 21H05149 - A.M. 및 21H05152 to Y.T.) 및 Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research(22K19178 - A. M.)의 지원을 받았습니다.
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재료
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참고문헌
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291(2016).
- Bourdais, G., et al.
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