Kvantificering af elastiske egenskaber af miljøbiofilm ved hjælp af optisk kohærenselastografi

Summary

Dette papir fremhæver OCE-teknikkens (optical coherence elastography) effektivitet i hurtigt og ikke-destruktivt karakteriserende biofilmelastiske egenskaber. Vi belyser kritiske OCE-implementeringsprocedurer for nøjagtige målinger og præsenterer Youngs modulværdier for to granulære biofilm.

Abstract

Biofilm er komplekse biomaterialer, der omfatter et velorganiseret netværk af mikrobielle celler indkapslet i egenproducerede ekstracellulære polymere stoffer (EPS). Dette papir præsenterer en detaljeret redegørelse for implementeringen af optiske kohærens elastografi (OCE) målinger skræddersyet til elastisk karakterisering af biofilm. OCE er en ikke-destruktiv optisk teknik, der muliggør lokal kortlægning af mikrostrukturen, morfologien og viskoelastiske egenskaber af delvist gennemsigtige bløde materialer med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Vi leverer en omfattende vejledning, der beskriver de væsentlige procedurer for korrekt implementering af denne teknik sammen med en metode til at estimere hovedparten af Youngs modul af granulære biofilm fra de indsamlede målinger. Disse består af systemopsætning, dataindsamling og efterbehandling. I diskussionen dykker vi ned i den underliggende fysik af de sensorer, der anvendes i OCE, og udforsker de grundlæggende begrænsninger vedrørende de rumlige og tidsmæssige skalaer af OCE-målinger. Vi konkluderer med potentielle fremtidige retninger for at fremme OCE-teknikken for at lette elastiske målinger af miljøbiofilm.

Introduction

I spildevandsbehandling og genvinding af vandressourcer anvendes gavnlige biofilm i tilknyttede vækstreaktorer i stigende grad for at gøre det muligt for mikrober at omdanne uønskede forurenende stoffer, såsom organisk materiale, nitrogen og fosfat, til stabiliserede former, der let kan fjernes fra vandet¹. I disse systemer er biofilmens emergente funktion, nemlig biokemiske transformationer, tæt forbundet med mangfoldigheden af mikrober, der bor i den, og de næringsstoffer, disse mikrober modtager². Derfor kan løbende biofilmvækst udgøre en udfordring for at opretholde ensartet reaktorfunktionalitet, fordi den nye biofilmvækst kan ændre biofilmens overordnede metaboliske processer, masseoverførselsegenskaber og samfundssammensætning. Stabilisering af biofilmmiljøet så meget som muligt kan beskytte mod sådanne ændringer³. Dette inkluderer at sikre en ensartet strøm af næringsstoffer og holde biofilmens struktur stabil med en stabil tykkelse⁴. Overvågning af biofilmens stivhed og fysiske struktur vil gøre det muligt for forskerne at få indsigt i biofilmens generelle sundhed og funktion.

Biofilm udviser viskoelastiske egenskaber ^5,6,7. Denne viskoelastiske natur resulterer i en kombination af en øjeblikkelig og langsom, tidsafhængig deformation som reaktion på eksterne mekaniske kræfter. Et unikt aspekt ved biofilm er, at når de udsættes for betydelig deformation, reagerer de som tyktflydende væsker. Omvendt, når de udsættes for mindre deformation, er deres respons sammenlignelig med faste stoffer⁵. Desuden er der inden for dette lille deformationsområde et deformationsområde, hvorunder biofilm udviser et lineært kraftforskydningsforhold ^5,6,7. Deformationer inden for dette lineære område er optimale til vurdering af biofilms mekaniske egenskaber, fordi disse giver reproducerbare målinger. Flere teknikker kan kvantificere det elastiske respons inden for dette område. Optisk kohærens elastografi (OCE) er en ny teknik, der tilpasses til analyse af biofilm i dette lineære område (stammer i størrelsesordenen 10-4-10-5)^8,9.

OCE’s hidtil mest etablerede anvendelse er inden for det biomedicinske område, hvor teknikken er blevet anvendt til at karakterisere biologiske væv, der kun kræver overfladisk optisk adgang. For eksempel brugte Li et al. OCE til at karakterisere de elastiske egenskaber af hudvæv¹⁰. Andre forfattere karakteriserede de anisotrope elastiske egenskaber hos svin og humant hornhindevæv, og hvordan de påvirkes af intraokulært tryk 11,12,13,14,15,16. Nogle fordele ved OCE-metoden til undersøgelse af biofilm er, at den er ikke-destruktiv og giver mesoskala rumlig opløsning, den kræver ingen prøveforberedelse, og selve metoden er hurtig; Det giver co-registrerede målinger af fysisk struktur og elastiske egenskaber (f.eks. porøsitet, overfladeruhed og morfologi)8,9,17,18.

OCE-metoden måler den lokale forskydning af formerende elastiske bølger i en prøve ved hjælp af fasefølsom optisk kohærenstomografi (OCT). OCT er et optisk interferometer med lav kohærens, der omdanner lokale ændringer i prøveforskydningen til en intensitetsændring, der registreres med et optisk spektrometer. OLT-teknikken er også blevet brugt i biofilmforskning til karakterisering af mesoskalastruktur, porøsitetsfordeling i tre dimensioner og biofilmdeformation 17,19,20,21. Derudover estimerede Picioreanu et al. biofilm mekaniske egenskaber ved hjælp af væske-struktur interaktion invers modellering af OCT tværsnitsdeformationsbilleder²².

På den anden side giver OCE-målinger kombineret med invers elastodynamisk bølgemodellering bølgehastigheden for elastiske bølger i prøven, hvilket muliggør karakterisering af prøvens elastiske og viskoelastiske egenskaber. Vores gruppe tilpassede OCE-teknikken til kvantitativ måling af biofilmelastiske og viskoelastiske egenskaber ^8,9,18 og validerede teknikken mod forskydningsreometrimålinger i agarosegelpladeprøver¹⁸. OCE-metoden giver præcise og pålidelige estimater af biofilmegenskaberne, da den målte elastiske bølgehastighed er korreleret med prøvens elastiske egenskaber. Desuden kan det rumlige henfald af den elastiske bølgeamplitude korreleres direkte med de viskoelastiske egenskaber på grund af viskøse virkninger i materialet. Vi har rapporteret OCE-målinger af viskoelastiske egenskaber af blandede kulturbakterielle biofilm dyrket på kuponer i en roterende ringformet reaktor (RAR) og granulære biofilm med komplekse geometrier ved hjælp af elastodynamiske bølgemodeller¹⁸.

OCE-teknikken er også et stærkt alternativ til traditionel reometri¹⁸, som bruges til viskoelastisk karakterisering. Reometrimetoder er bedst egnet til prøver med plan geometri. Som sådan kan granulære biofilm, som har vilkårlige former og overflademorfologier, ikke karakteriseres nøjagtigt på et reometer ^8,23. Derudover kan reometrimetoder i modsætning til OCE være udfordrende at tilpasse til realtidsmålinger, for eksempel under biofilmvækst i flowceller^24,25.

I denne artikel viser vi, at OCE-målinger af overfladebølgers frekvensuafhængige bølgehastighed kan bruges til at karakterisere biofilmens elastiske egenskaber uden behov for komplicerede modeller. Denne udvikling vil gøre OCE-tilgangen mere tilgængelig for det bredere biofilmsamfund til undersøgelse af biofilmens mekaniske egenskaber.

Figur 1 viser en skematisk illustration af det OLT-system, der anvendes i denne undersøgelse. Systemet indeholder flere instrumenter, herunder et kommercielt spektraldomæne fasefølsomt OCT-system, en forsinkelsesgenerator, en funktionsgenerator og en piezoelektrisk transducer. OLT-systemet fungerer efter princippet om interferometri ved at anvende en bredbåndslyskilde med en centerbølgelængde på 930 nm. Den indsamlede lysintensitet, som er korreleret med indviklede strukturelle detaljer i prøven, analyseres i efterbehandlingsenheden og konverteres derefter til et tværsnitsbillede af prøven – almindeligvis benævnt et OCT-billede. OCT-billeddybden afhænger af sværhedsgraden af den optiske spredning i prøven, der stammer fra lokal variation i brydningsindekset og er begrænset til 1-3 mm i biologiske væv og biofilm. Da den optiske fase i prøven og interferensintensiteten moduleres ved bevægelse, kan OLT bruges til at detektere den lokale prøveforskydning. Vi udnytter OCT’s forskydningsfølsomhed i OCE-metoden til at spore steady state-forskydningsfeltet for elastiske bølger i prøven. Specifikt udsender funktionsgeneratoren en sinusformet spænding for at drive den piezoelektriske transducer. Transduceren strækker sig igen og trækker sig sammen med en oscillerende tidshistorie. Transducerens oscillerende forskydning giver en sinusformet kraft på prøveoverfladen gennem en 3D-printet kilespids ved transducerens top, hvilket fører til generering af harmoniske elastiske bølger i prøven. Kilespidsen kommer let i kontakt med prøveemnet, således at prøven forbliver intakt, efter at aktuatoren er trukket tilbage fra prøveoverfladen. For at registrere den lokale forskydning i eksemplet hentes tilstødende dybdescanninger adskilt af en fast tidsforsinkelse ved hver pixel i prøven. Den optiske faseforskel mellem på hinanden følgende scanninger ved hvert pixelpunkt er proportional med den lokale lodrette forskydning på samme punkt. Synkronisering mellem forskydningen af transduceren og scanningsoptikken i OCT-systemet opnås gennem en triggerpuls, der stammer fra funktionsgeneratoren og forsinkes i forsinkelsesgeneratoren. Dette synkroniseringstrin letter erhvervelsen af konsistente tværsnitsbilleder af den lokale optiske fasefordeling i prøven. Disse billeder er direkte proportionale med den lokale lodrette harmoniske forskydning i prøven og kaldes OCE-billedet. OCE-billeder erhverves ved forskellige transduceraktiveringsfrekvenser for at opnå den elastiske bølgelængde og bølgehastighed som funktion af frekvensen. De målte bølgehastigheder analyseres med en elastodynamisk model for at bestemme prøvens elastiske egenskaber.

Protocol

1. System opsætning Saml systemkomponenterne, der inkluderer det kommercielle OCT-system (basisenhed, stativ, billedhoved og computer), bølgeformgenerator, transducer, forsinkelses- / pulsgenerator, en switch med BNC-forbindelser, BNC-kabler og adaptere, optiske indlæg og klemmer. Tilslut synkroniseringssignalet fra funktionsgeneratoren til en switch. Tilslut den anden port på kontakten til forsinkelsesgeneratoren. Tilslut funktionsgeneratorens udgang til transducerledni…

Representative Results

I denne undersøgelse brugte vi granulære biofilm (også kendt som granulært slam), som blev kommercielt opnået. Granulater er sfæriske biofilm, der dannes gennem selvaggregering, hvilket betyder, at de ikke kræver en bærer eller overflade, hvorpå de kan vokse26. Figur 3A viser et repræsentativt tværsnits-OLT-billede, der opstår på grund af den rumlige variation af det lokale brydningsindeks i en granulær biofilm. Biofilmen har en nominel…

Discussion

Den opnåelige billeddybde i OCT-systemet bestemmes af graden af lysindtrængning fra lyskilden, som afhænger af kildens bølgelængde. Desuden bestemmer bølgelængden den aksiale opløsning. Længere bølgelængder kan trænge dybere ind i prøven, men på bekostning af reduceret aksial opløsning sammenlignet med kortere bølgelængder. Tværgående opløsning er derimod afhængig af både systemets numeriske blænde og bølgelængden, hvor kortere bølgelængder leverer højere opløsning. Forøgelse af den numerisk…

Materials

3D printed sample holder
3D printed wedge tip			3 mm width
BNC cables	Any brand
Delay generator	Stanford Research Systems	DG535	DG535 Digital delay/ Pulse Generator
Function generator	Agilent Technologies		33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator
Granular biofilm	Aqua-Aerobic Systems		Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB	MathWorks		Release 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelectric transducer	Thorlabs	PK2JUP1	Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement
SD-OCT System	Thorlabs		Ganymede II, LSM03 scan lens
ThorImageOCT	Thorlabs		Version: 5.5.5