Kvantifiering av elastiska egenskaper hos miljöbiofilmer med hjälp av optisk koherenselastografi

Summary

Denna artikel belyser OCE-teknikens (optical coherence elastography) effektivitet när det gäller att snabbt och icke-destruktivt karakterisera biofilmens elastiska egenskaper. Vi belyser kritiska OCE-implementeringsprocedurer för noggranna mätningar och presenterar Youngs modulvärden för två granulära biofilmer.

Abstract

Biofilmer är komplexa biomaterial som består av ett välorganiserat nätverk av mikrobiella celler inneslutna i egenproducerade extracellulära polymera substanser (EPS). Denna artikel presenterar en detaljerad redogörelse för implementeringen av mätningar av optisk koherenselastografi (OCE) skräddarsydda för elastisk karakterisering av biofilmer. OCE är en icke-destruktiv optisk teknik som möjliggör lokal kartläggning av mikrostruktur, morfologi och viskoelastiska egenskaper hos delvis transparenta mjuka material med hög rumslig och tidsmässig upplösning. Vi tillhandahåller en omfattande guide som beskriver de viktigaste procedurerna för korrekt implementering av denna teknik, tillsammans med en metod för att uppskatta bulken av Youngs modul av granulära biofilmer från de insamlade mätningarna. Dessa består av systeminställning, datainsamling och efterbehandling. I diskussionen fördjupar vi oss i den underliggande fysiken hos de sensorer som används i OCE och utforskar de grundläggande begränsningarna när det gäller de rumsliga och tidsmässiga skalorna för OCE-mätningar. Vi avslutar med potentiella framtida riktningar för att utveckla OCE-tekniken för att underlätta elastiska mätningar av miljöbiofilmer.

Introduction

Vid rening av avloppsvatten och återvinning av vattenresurser används i allt högre grad fördelaktiga biofilmer i anslutna tillväxtreaktorer för att göra det möjligt för mikrober att omvandla oönskade föroreningar, såsom organiskt material, kväve och fosfat, till stabiliserade former som lätt kan avlägsnas från vattnet¹. I dessa system är biofilmens emergenta funktion, nämligen biokemiska omvandlingar, nära förknippad med mångfalden av mikrober som finns i den och de näringsämnen som dessa mikrober får². Följaktligen kan pågående biofilmstillväxt utgöra en utmaning för att upprätthålla konsekvent reaktorfunktionalitet eftersom den nya biofilmtillväxten kan förändra biofilmens övergripande metaboliska processer, massöverföringsegenskaper och samhällssammansättning. Att stabilisera biofilmmiljön så mycket som möjligt kan skydda mot sådana förändringar³. Detta inkluderar att säkerställa ett konsekvent flöde av näringsämnen och hålla biofilmens struktur stabil med en jämn tjocklek⁴. Genom att övervaka biofilmens styvhet och fysiska struktur skulle forskarna kunna få insikt i biofilmens allmänna hälsa och funktion.

Biofilmer uppvisar viskoelastiska egenskaper ^5,6,7. Denna viskoelastiska natur resulterar i en kombination av en omedelbar och långsam, tidsberoende deformation som svar på yttre mekaniska krafter. En unik aspekt av biofilmer är att de, när de utsätts för betydande deformation, reagerar som trögflytande vätskor. Omvänt, när de utsätts för mindre deformation, är deras respons jämförbar med fasta ämnen⁵. Dessutom, inom denna lilla deformationsregion, finns det ett deformationsområde under vilket biofilmer uppvisar ett linjärt kraft-förskjutningsförhållande ^5,6,7. Deformationer inom detta linjära område är optimala för att bedöma biofilmens mekaniska egenskaper eftersom dessa ger reproducerbara mätningar. Flera tekniker kan kvantifiera det elastiska svaret inom detta intervall. Optisk koherenselastografi (OCE) är en framväxande teknik som anpassas för att analysera biofilmer i detta linjära område (stammar i storleksordningen 10-4-10-5)^8,9.

OCE:s mest etablerade tillämpning hittills är inom det biomedicinska området, där tekniken har tillämpats för att karakterisera biologiska vävnader som endast kräver ytlig optisk åtkomst. Till exempel använde Li et al. OCE för att karakterisera de elastiska egenskaperna hos hudvävnad¹⁰. Andra författare karakteriserade de anisotropa elastiska egenskaperna hos svin och mänsklig hornhinnevävnad och hur de påverkas av intraokulärt tryck 11,12,13,14,15,16. Några fördelar med OCE-metoden för att studera biofilmer är att den är icke-destruktiv och ger mesoskalig rumslig upplösning, den kräver ingen provberedning och metoden i sig är snabb; Den ger samregistrerade mätningar av fysisk struktur och elastiska egenskaper (t.ex. porositet, ytjämnhet och morfologi)8,9,17,18.

OCE-metoden mäter den lokala förskjutningen av elastiska vågor i ett prov med hjälp av faskänslig optisk koherenstomografi (OCT). OCT är en optisk interferometer med låg koherens som omvandlar lokala förändringar i provförskjutningen till en intensitetsförändring som registreras med en optisk spektrometer. OCT-tekniken har också använts inom biofilmforskning för karakterisering av mesoskalig struktur, porositetsfördelning i tre dimensioner och biofilmsdeformation 17,19,20,21. Dessutom uppskattade Picioreanu et al. biofilmens mekaniska egenskaper med hjälp av invers modellering av OCT-tvärsnittsdeformationsbilder²².

Å andra sidan ger OCE-mätningar, i kombination med omvänd elastodynamisk vågmodellering, våghastigheten för elastiska vågor i provet, vilket möjliggör karakterisering av provets elastiska och viskoelastiska egenskaper. Vår grupp anpassade OCE-tekniken för kvantitativ mätning av biofilmens elastiska och viskoelastiska egenskaper ^8,9,18 och validerade tekniken mot skjuverreometrimätningar i agarosgelplattprover¹⁸. OCE-metoden ger exakta och tillförlitliga uppskattningar av biofilmens egenskaper eftersom den uppmätta elastiska våghastigheten är korrelerad med provets elastiska egenskaper. Dessutom kan det rumsliga sönderfallet av den elastiska vågamplituden direkt korreleras med de viskoelastiska egenskaperna på grund av viskösa effekter i materialet. Vi har rapporterat OCE-mätningar av viskoelastiska egenskaper hos bakteriebiofilmer med blandad kultur odlade på kuponger i en roterande ringformig reaktor (RAR) och granulära biofilmer med komplexa geometrier med hjälp av elastodynamiska vågmodeller¹⁸.

OCE-tekniken är också ett kraftfullt alternativ till traditionell reometri¹⁸som används för viskoelastisk karakterisering. Reometrimetoder lämpar sig bäst för prover med plan geometri. Som sådan kan granulära biofilmer, som har godtyckliga former och ytmorfologier, inte karakteriseras exakt på en reometer ^8,23. Dessutom, till skillnad från OCE, kan reometrimetoder vara utmanande att anpassa för realtidsmätningar, till exempel under biofilmstillväxt i flödesceller^24,25.

I denna artikel visar vi att OCE-mätningar av ytvågors frekvensoberoende våghastighet kan användas för att karakterisera biofilmens elastiska egenskaper utan behov av komplicerade modeller. Denna utveckling kommer att göra OCE-metoden mer tillgänglig för den bredare biofilmsgemenskapen för att studera biofilmens mekaniska egenskaper.

Figur 1 visar en schematisk illustration av OCT-systemet som används i denna studie. Systemet innehåller flera instrument, inklusive ett kommersiellt faskänsligt OCT-system med spektraldomän, en fördröjningsgenerator, en funktionsgenerator och en piezoelektrisk givare. OCT-systemet fungerar enligt principen om interferometri genom att använda en bredbandsljuskälla med en mittvåglängd på 930 nm. Den insamlade ljusintensiteten, som är korrelerad med intrikata strukturella detaljer i provet, analyseras i efterbehandlingsenheten och konverteras sedan till en tvärsnittsbild av provet – vanligen kallad OCT-bild. OCT-avbildningsdjupet beror på svårighetsgraden av den optiska spridningen i provet som härrör från lokal variation i brytningsindex och är begränsad till 1-3 mm i biologiska vävnader och biofilmer. Eftersom den optiska fasen i sample och interferensintensiteten moduleras av rörelse, kan OCT användas för att detektera den lokala provförskjutningen. Vi utnyttjar förskjutningskänsligheten hos OCT i OCE-metoden för att spåra steady state-förskjutningsfältet för elastiska vågor i provet. Specifikt matar funktionsgeneratorn ut en sinusformad spänning för att driva den piezoelektriska givaren. Givaren sträcker sig i sin tur och drar ihop sig med en oscillerande tidshistorik. Den oscillerande förskjutningen av givaren ger en sinusformad kraft på provytan genom en 3D-printad kilspets vid givarens spets, vilket leder till generering av harmoniska elastiska vågor i provet. Kilspetsen har lätt kontakt med provet, så att provet förblir intakt efter att ställdonet har dragits tillbaka från provytan. För att registrera den lokala förskjutningen i provet hämtas intilliggande djupskanningar separerade med en fast tidsfördröjning vid varje pixel i provet. Den optiska fasskillnaden mellan på varandra följande skanningar vid varje pixelpunkt är proportionell mot den lokala vertikala förskjutningen vid samma punkt. Synkronisering mellan givarens förskjutning och skanningsoptiken i OCT-systemet uppnås genom en triggerpuls som kommer från funktionsgeneratorn och fördröjs i fördröjningsgeneratorn. Detta synkroniseringssteg underlättar insamlingen av konsekventa tvärsnittsbilder av den lokala optiska fasfördelningen i provet. Dessa bilder är direkt proportionella mot den lokala vertikala harmoniska förskjutningen i exemplet och kallas OCE-bilden. OCE-bilder tas vid olika givaraktiveringsfrekvenser för att erhålla den elastiska våglängden och våghastigheten som en funktion av frekvensen. De uppmätta våghastigheterna analyseras med en elastodynamisk modell för att bestämma provets elastiska egenskaper.

Protocol

1. Inställning av systemet Samla systemkomponenterna som inkluderar det kommersiella OCT-systemet (basenhet, stativ, bildhuvud och dator), vågformsgenerator, givare, fördröjnings-/pulsgenerator, en switch med BNC-anslutningar, BNC-kablar och adaptrar, optiska stolpar och clamps. Anslut synksignalen från funktionsgeneratorn till en switch. Anslut den andra porten på omkopplaren till fördröjningsgeneratorn. Anslut funktionsgeneratorns utgång till givarkablarna. …

Representative Results

I den här studien använde vi granulära biofilmer (även känt som granulärt slam), som erhölls kommersiellt. Granulat är sfäriska biofilmer som bildas genom självaggregering, vilket innebär att de inte kräver en bärare eller yta att växa på26. Figur 3A visar en representativ tvärsnittsbild av OCT som uppstår på grund av den rumsliga variationen av det lokala brytningsindexet i en granulär biofilm. Biofilmen har en nominell diameter p…

Discussion

Det uppnåeliga avbildningsdjupet i OCT-systemet bestäms av graden av ljusgenomträngning från ljuskällan, vilket beror på källans våglängd. Dessutom bestämmer våglängden den axiella upplösningen. Längre våglängder kan tränga djupare in i provet men på bekostnad av minskad axiell upplösning jämfört med kortare våglängder. Tvärgående upplösning, å andra sidan, är beroende av både systemets numeriska bländare och våglängden, med kortare våglängder som ger högre upplösning. Att öka den num…

Materials

3D printed sample holder
3D printed wedge tip			3 mm width
BNC cables	Any brand
Delay generator	Stanford Research Systems	DG535	DG535 Digital delay/ Pulse Generator
Function generator	Agilent Technologies		33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator
Granular biofilm	Aqua-Aerobic Systems		Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB	MathWorks		Release 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelectric transducer	Thorlabs	PK2JUP1	Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement
SD-OCT System	Thorlabs		Ganymede II, LSM03 scan lens
ThorImageOCT	Thorlabs		Version: 5.5.5