Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente
Summary
Este protocolo describe un enfoque para la realización de imágenes de calcio en organoides intestinales humanos infectados por virus y ofrece un enfoque para el análisis.
Abstract
La señalización del calcio es un regulador integral de casi todos los tejidos. Dentro del epitelio intestinal, el calcio está involucrado en la regulación de la actividad secretora, la dinámica de la actina, las respuestas inflamatorias, la proliferación de células madre y muchas otras funciones celulares no caracterizadas. Como tal, el mapeo de la dinámica de señalización del calcio dentro del epitelio intestinal puede proporcionar información sobre los procesos celulares homeostáticos y revelar respuestas únicas a diversos estímulos. Los organoides intestinales humanos (HIO) son un modelo de alto rendimiento derivado del ser humano para estudiar el epitelio intestinal y, por lo tanto, representan un sistema útil para investigar la dinámica del calcio. Este artículo describe un protocolo para transducir de manera estable HIOs con indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs), realizar microscopía de fluorescencia en vivo y analizar datos de imágenes para caracterizar significativamente las señales de calcio. Como ejemplo representativo, las OHIO tridimensionales se transducieron con lentivirus para expresar de forma estable GCaMP6s, una GECI citosólica verde fluorescente basada en proteínas. A continuación, las OHIO modificadas se dispersaron en una suspensión unicelular y se sembraron como monocapas. Después de la diferenciación, las monocapas de HIO se infectaron con rotavirus y/o se trataron con fármacos que se sabe que estimulan una respuesta de calcio. Un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara de imágenes en vivo humidificada y con temperatura controlada permitió obtener imágenes a largo plazo de monocapas infectadas o tratadas con medicamentos. Después de la obtención de imágenes, las imágenes adquiridas se analizaron utilizando el software de análisis disponible gratuitamente, ImageJ. En general, este trabajo establece una línea adaptable para caracterizar la señalización celular en HIO.
Introduction
El calcio es un segundo mensajero ampliamente conservado que desempeña un papel fundamental en laregulación de la fisiología celular. Dada su fuerte carga, su pequeño tamaño y su alta solubilidad en condiciones fisiológicas, el calcio es un manipulador ideal de la conformación de las proteínas. Esto hace que el calcio sea un medio poderoso para transducir señales electroquímicas en alteraciones enzimáticas, transcripcionales o postranscripcionales. Los estrictos gradientes de concentración de calcio a través del retículo endoplásmico (RE) y las membranas plasmáticas crean una alta fuerza impulsora que permite cambios rápidos en la concentración de calcio citosólico. Múltiples mecanismos, incluyendo tanto la amortiguación como el transporte activo, mantienen estrechamente este gradiente. Si bien es necesario para las funciones celulares normales, este mantenimiento es energéticamente costoso, lo que lo hace particularmente susceptible en estados de estrés 2.
Como tal, la desregulación del calcio dentro del citosol es una señal casi universal de muchos tipos de estrés celular. Las alteraciones metabólicas, las toxinas, los patógenos, los daños mecánicos y las perturbaciones genéticas pueden alterar la señalización del calcio. Independientemente del estímulo, a nivel de toda la célula, los aumentos sostenidos e incontrolados del calcio citosólico pueden promover la apoptosis y, finalmente, la necrosis 3,4. Sin embargo, las alteraciones en los niveles citosólicos de calcio de menor amplitud o mayor frecuencia tienen efectos variables2. Del mismo modo, los resultados de las fluctuaciones de calcio pueden diferir en función del microdominio espacial en el que se producen5. Por lo tanto, el monitoreo de los niveles de calcio puede ofrecer información sobre los procesos de señalización dinámica, pero esto requiere un muestreo con una resolución temporal y espacial relativamente alta.
Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) son herramientas poderosas para el muestreo continuo en sistemas de células vivas6. Algunos de los GECI más utilizados son las proteínas fluorescentes sensibles al calcio basadas en GFP conocidas como GCaMPs7. El GCaMP canónico es una fusión de tres dominios proteicos distintos: una GFP permutada circularmente (cpGFP), calmodulina y M136. El dominio calmodulina sufre un cambio de conformación al unirse al calcio, lo que permite su interacción con M13. La interacción calmodulina-M13 induce un cambio conformacional en el cpGFP que aumenta su emisión fluorescente tras la excitación. Como tal, un aumento en la concentración de calcio se correlaciona con un aumento en la intensidad de fluorescencia de GCaMP. Estos sensores pueden ser citosólicos o dirigidos a orgánulos específicos8.
Al igual que la mayoría de los tejidos, el calcio regula una variedad de funciones dentro del epitelio gastrointestinal. El epitelio intestinal es fundamental para la absorción de nutrientes y líquidos, pero también debe formar una barrera hermética y una interfaz inmunitaria para evitar la invasión de patógenos o las agresiones tóxicas. Las vías dependientes del calcio influyen en casi todas estas funciones vitales 9,10,11. Sin embargo, la señalización del calcio dentro del epitelio intestinal sigue siendo una frontera poco explorada con un potencial prometedor como diana terapéutica. Si bien el monitoreo de la dinámica del calcio dentro del epitelio intestinal in vivo sigue presentando desafíos, los organoides intestinales humanos (HIO) ofrecen un sistema ex vivo adaptable para la experimentación12. Los HIO son esferoides tridimensionales (3D) derivados de células madre intestinales humanas y, al diferenciarse, recapitulan gran parte de la diversidad celular del epitelio intestinal nativo12.
Este protocolo describe métodos integrales para diseñar HIO que expresan GECI y luego preparar HIO diseñadas como monocapas para la obtención de imágenes de calcio de células vivas. Ofrece la infección viral como ejemplo de una manipulación patológica que interrumpe la señalización del calcio y proporciona un enfoque analítico para cuantificar estos cambios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las alteraciones en los niveles citosólicos de Ca2+ pueden ser tanto causa como efecto de patologías dentro del epitelio 10,16,17. Los aumentos en el calcio citosólico pueden impulsar directamente la secreción a través de la activación del canal de cloruro dependiente de calcio TMEM16A18,19. La activación de TMEM16A en respuesta a Ca2+ permit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones R01DK115507 y R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El apoyo de los aprendices fue proporcionado por el F30DK131828 de subvenciones de los NIH (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) y F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Nos gustaría agradecer al Centro Enteroide de Enfermedades Digestivas del Centro Médico de Texas por proporcionar los medios de mantenimiento de organoides.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
- Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
- Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
- Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
- Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
- Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
- Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
- Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
- Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
- Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
- Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
- Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
- Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
- Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
- Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
- Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
- Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
- Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
- Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
- Hyser, J. M., Estes, M. K. Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins. Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).
- Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
- Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
- Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
- Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
- Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
