Immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplex
Summary
L’immunohistochimie cyclique multiplex permet la détection in situ de plusieurs marqueurs simultanément en utilisant l’incubation répétée d’antigène-anticorps, le balayage d’images et l’alignement et l’intégration d’images. Nous présentons ici le protocole opératoire pour identifier les substrats des cellules immunitaires avec cette technologie dans des échantillons de cancer du poumon et de métastases cérébrales appariées.
Abstract
Le microenvironnement tumoral implique des interactions entre les cellules hôtes, les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules stromales et le système vasculaire. La caractérisation et l’organisation spatiale des sous-ensembles de cellules immunitaires et des protéines cibles sont cruciales à des fins pronostiques et thérapeutiques. Cela a conduit au développement de méthodes de coloration immunohistochimique multiplexées. L’immunohistochimie par fluorescence multiplex permet la détection simultanée de plusieurs marqueurs, facilitant une compréhension complète de la fonction cellulaire et des interactions intercellulaires. Dans cet article, nous décrivons un flux de travail pour le test d’immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplex et son application dans l’analyse de quantification de sous-ensembles de lymphocytes. La coloration multiplex par immunohistochimie par fluorescence cyclique suit des étapes et des réactifs similaires à ceux de l’immunohistochimie standard, impliquant la récupération d’antigènes, l’incubation d’anticorps cycliques et la coloration sur une lame de tissu fixée au formol et enrobée de paraffine (FFPE). Au cours de la réaction antigène-anticorps, un mélange d’anticorps de différentes espèces est préparé. Les conditions, telles que le temps de récupération de l’antigène et la concentration d’anticorps, sont optimisées et validées pour augmenter le rapport signal/bruit. Cette technique est reproductible et constitue un outil précieux pour la recherche en immunothérapie et les applications cliniques.
Introduction
Les métastases cérébrales représentent les tumeurs du système nerveux central (SNC) les plus courantes, survenant dans près de la moitié des cas de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), avec un mauvais pronostic1. On estime que 10 à 20 % des patients atteints de CPNPC sont déjà atteints de BM au moment du diagnostic initial, et qu’environ 40 % des cas de CPNPC développeront une BM au cours du traitement2. Le microenvironnement tumoral (TME) est étroitement associé à l’apparition du CPNPC et de la BM, y compris divers composants, tels que les vaisseaux sanguins, les fibroblastes, les macrophages, la matrice extracellulaire (ECM), les lymphoïdes, les cellules immunitaires dérivées de la moelle osseuse et les molécules de signalisation 3,4. Les cellules immunitaires microenvironnementales jouent un rôle crucial dans la croissance et le développement des cellules cancéreuses. Les métastases cérébrales présentent de nombreuses cibles thérapeutiques potentielles caractérisées par des microenvironnements immunologiques et des processus de signalisation complexes. Par exemple, les inhibiteurs de-1 ont montré une efficacité clinique pour les patients atteints de métastases cérébrales cancéreuses du poumon (LCBM) en tant qu’inhibiteur du point de contrôle immunitaire (ICI). Cependant, la fréquence des réponses au traitement par-1 varie entre le CPNPC primaire et le LCBM5, ce qui suggère que le microenvironnement immunitaire tumoral agit comme un régulateur essentiel des ICI.
L’immunohistochimie (IHC) est un outil inestimable dans les domaines de la biologie, de la médecine fondamentale et de la pathologie6. Cette méthode de détection visualise l’expression de l’antigène par l’interaction antigène-anticorps sur une lame de tissu7. L’IHC est utilisée pour diagnostiquer les marqueurs prédictifs, évaluer les marqueurs pronostiques, guider les thérapies ciblées et explorer les fonctions biologiques des cellules tumorales8. Cependant, la méthode IHC traditionnelle ne peut détecter qu’un seul biomarqueur à la fois. Pour remédier à cette limitation, l’innovation de la technologie immunohistochimique a conduit au développement de l’immunohistochimie par fluorescence multiplex (mfIHC), qui permet l’identification simultanée de plusieurs marqueurs protéiques sur la même lame de tissu, à la fois en fond clair et en champ fluorescent9. Cette avancée fournit une analyse précise de la composition cellulaire et des interactions moléculaires entre les cellules stromales, les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses au sein du TME.
Dans cette étude, nous présentons un protocole d’immunohistochimie cyclique multiplex pour analyser la distribution spatiale des cellules immunitaires. Deux anticorps primaires d’espèces différentes, comme le lapin et le rat, sont choisis pour l’incubation simultanée, suivis d’anticorps secondaires marqués par fluorescence. La récupération de l’antigène est effectuée après chaque série de réactions antigène-anticorps. L’autofluorescence est bloquée et le 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est utilisé pour colorer les noyaux. Le panel comprend la détection séquentielle des CD3, CD8, CD20 et CK, les cellules sont classées en fonction des marqueurs : cellules tumorales (CK+), cellules T matures (CD3+), cellules T cytotoxiques (CD3+CD8+), cellules B (CD20+)10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit le processus de coloration par immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplexe. La sélection des anticorps primaires est un aspect crucial du test d’immunohistochimie de fluorescence, et les anticorps monoclonaux sont recommandés pour une meilleure spécificité et répétabilité. Pour optimiser la concentration de travail de l’anticorps primaire, une série de dilutions a été testée par des expériences d’immunohistochimie. Les contrôles positifs (pour évaluer l’expression de l?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NO.81860413, 81960455), le Fonds du Département des sciences et de la technologie du Yunnan (202001AY070001-080), la Fondation de la recherche scientifique du Département de l’éducation de la province du Yunnan (2019J1274).
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
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