मल्टीप्लेक्स चक्रीय फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
Summary
मल्टीप्लेक्स चक्रीय इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री बार-बार एंटीजन-एंटीबॉडी इनक्यूबेशन, इमेज स्कैनिंग और इमेज अलाइनमेंट और एकीकरण का उपयोग करके एक साथ कई मार्करों का पता लगाने की अनुमति देता है। यहां, हम फेफड़ों के कैंसर और युग्मित मस्तिष्क मेटास्टेसिस नमूनों में इस तकनीक के साथ प्रतिरक्षा कोशिका सब्सट्रेट की पहचान करने के लिए ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में मेजबान कोशिकाओं, ट्यूमर कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, स्ट्रोमल कोशिकाओं और वाहिका के बीच बातचीत शामिल है। प्रतिरक्षा सेल सबसेट और लक्ष्य प्रोटीन की विशेषता और स्थानिक रूप से आयोजन रोगनिरोधी और चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं। इससे मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला तरीकों का विकास हुआ है। मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री कई मार्करों का एक साथ पता लगाने की अनुमति देता है, जिससे सेल फ़ंक्शन और इंटरसेलुलर इंटरैक्शन की व्यापक समझ की सुविधा मिलती है। इस पत्र में, हम मल्टीप्लेक्स चक्रीय फ्लोरोसेंट immunohistochemistry परख और लिम्फोसाइट subsets की मात्रा का ठहराव विश्लेषण में अपने आवेदन के लिए एक कार्यप्रवाह का वर्णन. मल्टीप्लेक्स चक्रीय फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के समान चरणों और अभिकर्मकों का पालन करता है, जिसमें एंटीजन पुनर्प्राप्ति, चक्रीय एंटीबॉडी इनक्यूबेशन और फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक स्लाइड पर धुंधला हो जाना शामिल है। एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के दौरान, विभिन्न प्रजातियों से एंटीबॉडी का मिश्रण तैयार किया जाता है। एंटीजन पुनर्प्राप्ति समय और एंटीबॉडी एकाग्रता जैसी स्थितियां सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए अनुकूलित और मान्य हैं। यह तकनीक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इम्यूनोथेरेपी अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में कार्य करती है।
Introduction
मस्तिष्क मेटास्टेस (बीएम) सबसे आम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के मामलों (एनएससीएलसी) के लगभग आधे हिस्से में होता है, जिसमें खराब रोग का निदानहोता है। प्रारंभिक निदान के समय अनुमानित 10% -20% एनएससीएलसी रोगियों में पहले से ही बीएम है, और लगभग 40% एनएससीएलसीमामले उपचार के दौरान बीएम विकसित करेंगे। ट्यूमर microenvironment (TME) बारीकी से NSCLC घटना और बीएम, इस तरह के रक्त वाहिकाओं, fibroblasts, मैक्रोफेज, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम), लिम्फोइड, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और सिग्नलिंग अणुओं 3,4 के रूप में विभिन्न घटकों सहित के साथ जुड़ा हुआ है. माइक्रोएन्वायरमेंटल प्रतिरक्षा कोशिकाएं कैंसर कोशिका वृद्धि और विकास को प्रभावित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। मस्तिष्क मेटास्टेस जटिल प्रतिरक्षाविज्ञानी माइक्रोएन्वायरमेंट और सिग्नलिंग प्रक्रियाओं की विशेषता वाले कई संभावित उपचार लक्ष्य प्रस्तुत करते हैं। उदाहरण के लिए, पीडी -1 अवरोधकों ने प्रतिरक्षा-चेकपॉइंट अवरोधक (आईसीआई) के रूप में फेफड़ों के कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस (एलसीबीएम) वाले रोगियों के लिए नैदानिक प्रभावकारिता दिखाई है। हालांकि, पीडी -1 थेरेपी के लिए प्रतिक्रियाओं की आवृत्ति प्राथमिक एनएससीएलसी और एलसीबीएम5 के बीच भिन्न होती है, यह सुझाव देती है कि ट्यूमर प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट एक महत्वपूर्ण आईसीआई नियामक के रूप में कार्य करता है।
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) जीव विज्ञान, नींव चिकित्सा और विकृति विज्ञान के क्षेत्र में एक अमूल्य उपकरणहै 6. यह पता लगाने की विधि ऊतक स्लाइड 7 पर एंटीजन-एंटीबॉडी की बातचीत के माध्यम से एंटीजन अभिव्यक्ति की कल्पना करतीहै। आईएचसी भविष्य कहनेवाला मार्करों के निदान, रोगनिरोधी मार्करों का मूल्यांकन, लक्षित चिकित्सा मार्गदर्शन, और ट्यूमर कोशिकाओं8 के जैविक कार्यों की खोज के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, पारंपरिक आईएचसी विधि एक समय में केवल एक बायोमार्कर का पता लगा सकती है। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रौद्योगिकी के नवाचार ने मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (एमएफआईएचसी) का विकास किया है, जो एक ही ऊतक स्लाइड पर कई प्रोटीन मार्करों की एक साथ पहचान के लिए अनुमति देता है, दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट क्षेत्र9 में। यह प्रगति TME के भीतर स्ट्रोमल कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं के बीच सेल संरचना और आणविक बातचीत का सटीक विश्लेषण प्रदान करती है।
इस अध्ययन में, हम प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानिक वितरण का विश्लेषण करने के लिए मल्टीप्लेक्स चक्रीय इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। खरगोश और चूहे जैसे विभिन्न प्रजातियों के दो प्राथमिक एंटीबॉडी को एक साथ इनक्यूबेशन के लिए चुना जाता है, इसके बाद प्रतिदीप्ति-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी होते हैं। एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के प्रत्येक दौर के बाद एंटीजन पुनर्प्राप्ति की जाती है। ऑटोफ्लोरेसेंस अवरुद्ध है, और 4 ‘, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) का उपयोग नाभिक को धुंधला करने के लिए किया जाता है। पैनल में सीडी 3, सीडी 8, सीडी 20 और सीके का अनुक्रमिक पता लगाना शामिल है, कोशिकाओं को मार्करों के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है: ट्यूमर कोशिकाएं (सीके +), परिपक्व टी कोशिकाएं (सीडी 3 +), साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाएं (सीडी 3 + सीडी 8 +), बी कोशिकाएं (सीडी 20 +) 10,11।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने मल्टीप्लेक्स चक्रीय प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला होने की प्रक्रिया का वर्णन किया है। प्राथमिक एंटीबॉडी चयन प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री परख का एक महत्वपूर्ण पहलू है, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (NO.81860413, 81960455), युन्नान साइंस एंड टेक्नोलॉजी डिपार्टमेंट फंड (202001AY070001-080), साइंटिफिक रिसर्च फाउंडेशन ऑफ एजुकेशन डिपार्टमेंट ऑफ युन्नान प्रोविंस (2019J1274) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
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