Immunoistochimica fluorescente ciclica multiplex
Summary
L’immunoistochimica ciclica multiplex consente la rilevazione in situ di più marcatori contemporaneamente utilizzando l’incubazione ripetuta antigene-anticorpo, la scansione delle immagini e l’allineamento e l’integrazione delle immagini. Qui, presentiamo il protocollo operativo per l’identificazione dei substrati delle cellule immunitarie con questa tecnologia in campioni di carcinoma polmonare e metastasi cerebrali accoppiate.
Abstract
Il microambiente tumorale coinvolge le interazioni tra cellule ospiti, cellule tumorali, cellule immunitarie, cellule stromali e vascolarizzazione. La caratterizzazione e l’organizzazione spaziale dei sottoinsiemi di cellule immunitarie e delle proteine bersaglio sono cruciali per scopi prognostici e terapeutici. Ciò ha portato allo sviluppo di metodi di colorazione immunoistochimica multiplexati. L’immunoistochimica a fluorescenza multiplex consente la rilevazione simultanea di più marcatori, facilitando una comprensione completa della funzione cellulare e delle interazioni intercellulari. In questo articolo, descriviamo un flusso di lavoro per il test di immunoistochimica fluorescente ciclica multiplex e la sua applicazione nell’analisi di quantificazione di sottogruppi di linfociti. La colorazione immunoistochimica fluorescente ciclica multiplex segue passaggi e reagenti simili a quelli dell’immunoistochimica standard, che prevede il recupero dell’antigene, l’incubazione ciclica degli anticorpi e la colorazione su un vetrino di tessuto in formalina fissata con paraffina (FFPE). Durante la reazione antigene-anticorpo, viene preparata una miscela di anticorpi di specie diverse. Le condizioni, come il tempo di recupero dell’antigene e la concentrazione di anticorpi, sono ottimizzate e convalidate per aumentare il rapporto segnale/rumore. Questa tecnica è riproducibile e funge da strumento prezioso per la ricerca sull’immunoterapia e le applicazioni cliniche.
Introduction
Le metastasi cerebrali (BM) rappresentano i tumori più comuni del sistema nervoso centrale (SNC), che si verificano in quasi la metà dei casi di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), con una prognosi sfavorevole1. Si stima che il 10%-20% dei pazienti con NSCLC abbia già BM al momento della diagnosi iniziale e circa il 40% dei casi di NSCLC svilupperà BM durante il corso del trattamento2. Il microambiente tumorale (TME) è strettamente associato all’insorgenza di NSCLC e al midollo osseo, compresi vari componenti, come vasi sanguigni, fibroblasti, macrofagi, matrice extracellulare (ECM), cellule immunitarie linfoidi, derivate dal midollo osseo e molecole di segnalazione 3,4. Le cellule immunitarie microambientali svolgono un ruolo cruciale nell’influenzare la crescita e lo sviluppo delle cellule tumorali. Le metastasi cerebrali presentano numerosi potenziali bersagli terapeutici caratterizzati da complessi microambienti immunologici e processi di segnalazione. Ad esempio, gli inibitori di PD-1 hanno mostrato efficacia clinica per i pazienti con metastasi cerebrali da carcinoma polmonare (LCBM) come inibitore del checkpoint immunitario (ICI). Tuttavia, la frequenza delle risposte alla terapia con PD-1 varia tra NSCLC primario e LCBM5, suggerendo che il microambiente immunitario del tumore agisce come un regolatore critico dell’ICI.
L’immunoistochimica (IHC) è uno strumento inestimabile nei campi della biologia, della medicina di base e della patologia6. Questo metodo di rilevamento visualizza l’espressione dell’antigene attraverso l’interazione antigene-anticorpo su un vetrino tissutale7. L’IHC viene utilizzato per diagnosticare marcatori predittivi, valutare i marcatori prognostici, guidare terapie mirate ed esplorare le funzioni biologiche delle cellule tumorali8. Tuttavia, il metodo IHC tradizionale è in grado di rilevare un solo biomarcatore alla volta. Per ovviare a questa limitazione, l’innovazione della tecnologia immunoistochimica ha portato allo sviluppo dell’immunoistochimica a fluorescenza multiplex (mfIHC), che consente l’identificazione simultanea di più marcatori proteici sullo stesso vetrino tissutale, sia in campo chiaro che in campo fluorescente9. Questo progresso fornisce un’analisi accurata della composizione cellulare e delle interazioni molecolari tra le cellule stromali, le cellule immunitarie e le cellule tumorali all’interno della TME.
In questo studio, presentiamo un protocollo per l’immunoistochimica ciclica multiplex per analizzare la distribuzione spaziale delle cellule immunitarie. Due anticorpi primari di specie diverse, come coniglio e ratto, vengono scelti per l’incubazione contemporaneamente, seguiti da anticorpi secondari marcati con fluorescenza. Il recupero dell’antigene viene eseguito dopo ogni ciclo di reazione antigene-anticorpo. L’autofluorescenza viene bloccata e il 4′, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) viene utilizzato per colorare i nuclei. Il pannello include la rilevazione sequenziale di CD3, CD8, CD20 e CK, le cellule sono classificate in base ai marcatori: cellule tumorali (CK+), cellule T mature (CD3+), cellule T citotossiche (CD3+CD8+), cellule B (CD20+)10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto il processo per la colorazione immunoistochimica a fluorescenza ciclica multiplex. La selezione degli anticorpi primari è un aspetto cruciale del test di immunoistochimica a fluorescenza e gli anticorpi monoclonali sono raccomandati per una migliore specificità e ripetibilità. Per ottimizzare la concentrazione di lavoro dell’anticorpo primario, sono state testate una serie di diluizioni attraverso esperimenti di immunoistochimica. Sia i controlli positivi (per valutare l’espressione dell’antigene ber…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NO.81860413, 81960455), dal Fondo del Dipartimento di Scienza e Tecnologia dello Yunnan (202001AY070001-080), dalla Fondazione per la Ricerca Scientifica del Dipartimento dell’Istruzione della Provincia dello Yunnan (2019J1274).
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
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