Inmunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex
Summary
La inmunohistoquímica cíclica múltiple permite la detección in situ de múltiples marcadores simultáneamente mediante la incubación repetida antígeno-anticuerpo, el escaneo de imágenes y la alineación e integración de imágenes. En este trabajo se presenta el protocolo operativo para la identificación de sustratos de células inmunitarias con esta tecnología en muestras de cáncer de pulmón y metástasis cerebrales pareadas.
Abstract
El microambiente tumoral implica interacciones entre las células huésped, las células tumorales, las células inmunitarias, las células estromales y la vasculatura. La caracterización y organización espacial de los subconjuntos de células inmunitarias y las proteínas diana son cruciales para fines pronósticos y terapéuticos. Esto ha llevado al desarrollo de métodos de tinción inmunohistoquímica multiplexada. La inmunohistoquímica de fluorescencia múltiple permite la detección simultánea de múltiples marcadores, lo que facilita una comprensión integral de la función celular y las interacciones intercelulares. En este artículo, describimos un flujo de trabajo para el ensayo de inmunohistoquímica fluorescente cíclico múltiple y su aplicación en el análisis de cuantificación de subconjuntos de linfocitos. La tinción inmunohistoquímica fluorescente cíclica múltiple sigue pasos y reactivos similares a los de la inmunohistoquímica estándar, que incluye la recuperación de antígenos, la incubación cíclica de anticuerpos y la tinción en un portaobjetos de tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE). Durante la reacción antígeno-anticuerpo, se prepara una mezcla de anticuerpos de diferentes especies. Las condiciones, como el tiempo de recuperación de antígenos y la concentración de anticuerpos, se optimizan y validan para aumentar la relación señal-ruido. Esta técnica es reproducible y sirve como una herramienta valiosa para la investigación de inmunoterapia y aplicaciones clínicas.
Introduction
Las metástasis cerebrales (MO) representan los tumores más comunes del sistema nervioso central (SNC), que se presentan en casi la mitad de los casos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), con un pronóstico precario1. Se estima que entre el 10% y el 20% de los pacientes con CPNM ya tienen MO en el momento del diagnóstico inicial, y aproximadamente el 40% de los casos de CPNM desarrollarán MO durante el cursodel tratamiento. El microambiente tumoral (TME) está estrechamente asociado con la aparición de CPCNP y la MO, incluyendo varios componentes, como vasos sanguíneos, fibroblastos, macrófagos, matriz extracelular (MEC), células inmunitarias linfoides, derivadas de la médula ósea y moléculas de señalización 3,4. Las células inmunitarias microambientales desempeñan un papel crucial en la influencia del crecimiento y desarrollo de las células cancerosas. Las metástasis cerebrales presentan numerosas dianas terapéuticas potenciales caracterizadas por microambientes inmunológicos complejos y procesos de señalización. Por ejemplo, los inhibidores de PD-1 han demostrado eficacia clínica para pacientes con metástasis cerebral de cáncer de pulmón (LCBM) como inhibidor de puntos de control inmunitario (ICI). Sin embargo, la frecuencia de las respuestas a la terapia con PD-1 varía entre el CPCNP primario y el LCBM5, lo que sugiere que el microambiente inmunitario tumoral actúa como un regulador crítico de la ICI.
La inmunohistoquímica (IHQ) es una herramienta invaluable en los campos de la biología, la medicina básica y la patología6. Este método de detección visualiza la expresión de antígeno a través de la interacción antígeno-anticuerpo en un portaobjetos de tejido7. La IHQ se utiliza para diagnosticar marcadores predictivos, evaluar marcadores pronósticos, guiar terapias dirigidas y explorar las funciones biológicas de las células tumorales8. Sin embargo, el método tradicional de IHQ solo puede detectar un biomarcador a la vez. Para hacer frente a esta limitación, la innovación de la tecnología inmunohistoquímica ha llevado al desarrollo de la inmunohistoquímica de fluorescencia múltiple (mfIHC), que permite la identificación simultánea de múltiples marcadores proteicos en el mismo portaobjetos tisular, tanto en campo claro como en campo fluorescente9. Este avance proporciona un análisis preciso de la composición celular y las interacciones moleculares entre las células estromales, las células inmunitarias y las células cancerosas dentro de la TME.
En este estudio, presentamos un protocolo de inmunohistoquímica cíclica múltiple para analizar la distribución espacial de las células inmunes. Se eligen dos anticuerpos primarios de diferentes especies, como conejo y rata, para la incubación simultáneamente, seguidos de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. La recuperación de antígenos se realiza después de cada ronda de reacción antígeno-anticuerpo. Se bloquea la autofluorescencia y se utiliza 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos. El panel incluye la detección secuencial de células CD3, CD8, CD20 y CK, las células se clasifican según los marcadores: células tumorales (CK+), células T maduras (CD3+), células T citotóxicas (CD3+CD8+), células B (CD20+)10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito el proceso de tinción inmunohistoquímica de fluorescencia cíclica multiplex. La selección primaria de anticuerpos es un aspecto crucial del ensayo de inmunohistoquímica de fluorescencia, y se recomiendan los anticuerpos monoclonales para una mejor especificidad y repetibilidad. Para optimizar la concentración de trabajo del anticuerpo primario, se han probado una serie de diluciones mediante experimentos de inmunohistoquímica. Tanto los controles positivos (para evaluar la expresión del antígeno d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NO.81860413, 81960455), el Fondo del Departamento de Ciencia y Tecnología de Yunnan (202001AY070001-080), la Fundación de Investigación Científica del Departamento de Educación de la Provincia de Yunnan (2019J1274).
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
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