Multiplex cyklisk fluorescerande immunhistokemi
Summary
Multiplex cyklisk immunhistokemi möjliggör in situ-detektion av flera markörer samtidigt med hjälp av upprepad antigen-antikroppsinkubation, bildskanning och bildjustering och integration. Här presenterar vi operationsprotokollet för att identifiera immuncellssubstrat med denna teknik i lungcancer och parade hjärnmetastasprover.
Abstract
Tumörens mikromiljö involverar interaktioner mellan värdceller, tumörceller, immunceller, stromaceller och kärl. Att karakterisera och rumsligt organisera immuncellers undergrupper och målproteiner är avgörande för prognostiska och terapeutiska ändamål. Detta har lett till utvecklingen av multiplexerade immunhistokemiska färgningsmetoder. Multiplex fluorescensimmunhistokemi möjliggör samtidig detektion av flera markörer, vilket underlättar en omfattande förståelse av cellfunktion och intercellulära interaktioner. I den här artikeln beskriver vi ett arbetsflöde för multiplex cyklisk fluorescerande immunhistokemianalys och dess tillämpning i kvantifieringsanalys av lymfocytundergrupper. Den multiplexa cykliska fluorescerande immunhistokemiska färgningen följer liknande steg och reagenser som standardimmunhistokemi, vilket involverar antigenhämtning, cyklisk antikroppsinkubation och färgning på ett formalinfixerat paraffininbäddat (FFPE) vävnadsglas. Under antigen-antikroppsreaktionen framställs en blandning av antikroppar från olika arter. Förhållanden, såsom antigenhämtningstid och antikroppskoncentration, optimeras och valideras för att öka signal-brusförhållandet. Denna teknik är reproducerbar och fungerar som ett värdefullt verktyg för immunterapiforskning och kliniska tillämpningar.
Introduction
Hjärnmetastaser (BM) är de vanligaste tumörerna i centrala nervsystemet (CNS) och förekommer i nästan hälften av fallen av icke-småcellig lungcancer (NSCLC), med en dålig prognos1. Uppskattningsvis 10-20 % av NSCLC-patienterna har BM redan vid tidpunkten för den första diagnosen, och cirka 40 % av NSCLC-fallen kommer att utveckla BM under behandlingens gång2. Tumörens mikromiljö (TME) är nära förknippad med förekomst av NSCLC och BM, inklusive olika komponenter, såsom blodkärl, fibroblaster, makrofager, extracellulär matris (ECM), lymfoida, benmärgsderiverade immunceller och signalmolekyler 3,4. Mikroekologiska immunceller spelar en avgörande roll för att påverka cancercellers tillväxt och utveckling. Hjärnmetastaser utgör många potentiella behandlingsmål som kännetecknas av komplexa immunologiska mikromiljöer och signalprocesser. Till exempel har PD-1-hämmare visat klinisk effekt för patienter med lungcancerhjärnmetastaser (LCBM) som en immuncheckpointhämmare (ICI). Frekvensen av svar på PD-1-behandling varierar dock mellan primär NSCLC och LCBM5, vilket tyder på att tumörens immunmikromiljö fungerar som en kritisk ICI-regulator.
Immunhistokemi (IHC) är ett ovärderligt verktyg inom biologi, grundmedicin och patologi6. Denna detektionsmetod visualiserar antigenuttryck genom interaktion mellan antigen-antikropp på ett vävnadsglas7. IHC används för att diagnostisera prediktiva markörer, utvärdera prognostiska markörer, vägleda riktade terapier och utforska tumörcellers biologiska funktioner8. Den traditionella IHC-metoden kan dock bara detektera en biomarkör åt gången. För att ta itu med denna begränsning har innovationen av immunhistokemisk teknik lett till utvecklingen av multiplex fluorescensimmunhistokemi (mfIHC), som möjliggör samtidig identifiering av flera proteinmarkörer på samma vävnadsglas, både i ljusfält och fluorescensfält9. Detta framsteg möjliggör en noggrann analys av cellsammansättning och molekylära interaktioner mellan stromaceller, immunceller och cancerceller inom TME.
I denna studie presenterar vi ett protokoll för multiplex cyklisk immunhistokemi för att analysera den rumsliga fördelningen av immunceller. Två primära antikroppar av olika arter, såsom kanin och råtta, väljs ut för inkubation samtidigt, följt av fluorescensmärkta sekundära antikroppar. Antigenhämtning utförs efter varje omgång av antigen-antikroppsreaktion. Autofluorescens blockeras och 4′, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) används för färgning av kärnorna. Panelen inkluderar sekventiell detektion av CD3, CD8, CD20 och CK, celler kategoriseras enligt markörerna: tumörceller (CK+), mogna T-celler (CD3+), cytotoxiska T-celler (CD3+CD8+), B-celler (CD20+)10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrivit processen för multiplex cyklisk fluorescens immunhistokemisk färgning. Det primära antikroppsvalet är en avgörande aspekt av fluorescensimmunohistokemianalysen, och monoklonala antikroppar rekommenderas för bättre specificitet och repeterbarhet. För att optimera arbetskoncentrationen av den primära antikroppen har en serie utspädningar testats genom immunhistokemiska experiment. Både positiva kontroller (för att bedöma målantigenuttrycket) och negativa kontroller (ingen primär antikroppsin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (NO.81860413, 81960455), Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), Scientific Research Foundation of Education Department of Yunnan Province (2019J1274).
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
- Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
- Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
- Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
- Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
- Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
- Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
- Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
- Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
- Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
- McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
- Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
