Multipleks Siklik Floresan İmmünohistokimya
Summary
Multipleks siklik immünohistokimya, tekrarlanan antijen-antikor inkübasyonu, görüntü taraması ve görüntü hizalama ve entegrasyonu kullanılarak aynı anda birden fazla belirtecin in situ tespitine izin verir. Burada, akciğer kanseri ve eşleştirilmiş beyin metastazı örneklerinde bu teknoloji ile immün hücre substratlarının tanımlanması için çalışma protokolünü sunuyoruz.
Abstract
Tümör mikroçevresi, konakçı hücreler, tümör hücreleri, bağışıklık hücreleri, stromal hücreler ve vaskülatür arasındaki etkileşimleri içerir. İmmün hücre alt kümelerinin ve hedef proteinlerin karakterize edilmesi ve uzamsal olarak düzenlenmesi prognostik ve terapötik amaçlar için çok önemlidir. Bu durum çoğullanmış immünohistokimya boyama yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Multipleks floresan immünohistokimyası, hücre fonksiyonunun ve hücreler arası etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırarak çoklu belirteçlerin aynı anda saptanmasına izin verir. Bu yazıda, multipleks siklik floresan immünohistokimya testi için bir iş akışı ve lenfosit alt kümelerinin kantitifikasyon analizinde uygulanması açıklanmaktadır. Multipleks siklik floresan immünohistokimya boyama, antijen alımı, siklik antikor inkübasyonu ve formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) bir doku lamı üzerinde boyamayı içeren standart immünohistokimya ile benzer adımları ve reaktifleri takip eder. Antijen-antikor reaksiyonu sırasında, farklı türlerden bir antikor karışımı hazırlanır. Antijen alma süresi ve antikor konsantrasyonu gibi koşullar, sinyal-gürültü oranını artırmak için optimize edilir ve doğrulanır. Bu teknik tekrarlanabilir ve immünoterapi araştırmaları ve klinik uygulamalar için değerli bir araç olarak hizmet eder.
Introduction
Beyin metastazları (BM), küçük hücreli dışı akciğer kanseri vakalarının (KHDAK) yaklaşık yarısında meydana gelen ve kötü prognozlu en yaygın merkezi sinir sistemi (MSS) tümörlerini temsil eder1. KHDAK hastalarının tahminen %10-20’si ilk tanı sırasında zaten BM’ye sahiptir ve KHDAK vakalarının yaklaşık %40’ında tedavi sırasında KHDAK gelişecektir2. Tümör mikroçevresi (TME), kan damarları, fibroblastlar, makrofajlar, hücre dışı matriks (ECM), lenfoid, kemik iliği kaynaklı bağışıklık hücreleri ve sinyal molekülleri gibi çeşitli bileşenler dahil olmak üzere NSCLC oluşumu ve BM ile yakından ilişkilidir 3,4. Mikroçevresel bağışıklık hücreleri, kanser hücresi büyümesini ve gelişimini etkilemede çok önemli bir rol oynar. Beyin metastazları, karmaşık immünolojik mikroortamlar ve sinyalizasyon süreçleri ile karakterize çok sayıda potansiyel tedavi hedefi sunar. Örneğin, PD-1 inhibitörleri, bir bağışıklık kontrol noktası inhibitörü (ICI) olarak akciğer kanseri beyin metastazı (LCBM) olan hastalar için klinik etkinlik göstermiştir. Bununla birlikte, PD-1 tedavisine yanıtların sıklığı primer KHDAK ve LCBM5 arasında değişir, bu da tümör immün mikroçevresinin kritik bir ICI düzenleyici görevi gördüğünü düşündürür.
İmmünohistokimya (IHC) biyoloji, temel tıp ve patoloji alanlarında paha biçilmez bir araçtır6. Bu tespit yöntemi, bir doku lamı7 üzerindeki antijen-antikorun etkileşimi yoluyla antijen ekspresyonunu görselleştirir. IHC, prediktif belirteçleri teşhis etmek, prognostik belirteçleri değerlendirmek, hedefe yönelik tedavileri yönlendirmek ve tümör hücrelerinin biyolojik işlevlerini araştırmak için kullanılır8. Bununla birlikte, geleneksel IHC yöntemi bir seferde yalnızca bir biyobelirteç tespit edebilir. Bu sınırlamayı ele almak için, immünohistokimyasal teknolojinin yeniliği, hem parlak alanda hem de floresan alanda aynı doku lamı üzerinde birden fazla protein belirtecinin aynı anda tanımlanmasına izin veren multipleks floresan immünohistokimyasının (mfIHC) geliştirilmesine yol açmıştır9. Bu ilerleme, TME içindeki stromal hücreler, bağışıklık hücreleri ve kanser hücreleri arasındaki hücre bileşiminin ve moleküler etkileşimlerin doğru analizini sağlar.
Bu çalışmada, immün hücrelerin mekansal dağılımını analiz etmek için multipleks siklik immünohistokimya için bir protokol sunuyoruz. Tavşan ve sıçan gibi farklı türlerin iki birincil antikoru aynı anda inkübasyon için seçilir, ardından floresan etiketli ikincil antikorlar gelir. Antijen alımı, her antijen-antikor reaksiyonu turundan sonra gerçekleştirilir. Otofloresan bloke edilir ve çekirdekleri boyamak için 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kullanılır. Panel, CD3, CD8, CD20 ve CK’nin sıralı tespitini içerir, hücreler belirteçlere göre kategorize edilir: tümör hücreleri (CK +), olgun T hücreleri (CD3 +), sitotoksik T hücreleri (CD3 + CD8 +), B hücreleri (CD20 +) 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Multipleks siklik floresan immünohistokimya boyama sürecini tanımladık. Primer antikor seçimi, floresan immünohistokimya testinin çok önemli bir yönüdür ve daha iyi özgüllük ve tekrarlanabilirlik için monoklonal antikorlar önerilir. Primer antikorun çalışma konsantrasyonunu optimize etmek için, immünohistokimya deneyleri yoluyla bir dizi seyreltme test edilmiştir. Hem pozitif kontroller (hedef antijen ekspresyonunu değerlendirmek için) hem de negatif kontroller (primer antikor inkübasyonu yok) es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NO.81860413, 81960455), Yunnan Bilim ve Teknoloji Departmanı Fonu (202001AY070001-080), Yunnan Eyaleti Eğitim Departmanı Bilimsel Araştırma Vakfı (2019J1274) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
- Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
- Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
- Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
- Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
- Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
- Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
- Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
- Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
- Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
- McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
- Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
