Epon Post Встраивание коррелятивной световой и электронной микроскопии
Summary
Мы представляем подробный протокол послевстраивающей коррелятивной световой и электронной микроскопии Epon с использованием флуоресцентного белка mScarlet. Этот метод позволяет поддерживать флуоресценцию и ультраструктуру одновременно. Эта методика поддается широкому спектру биологических применений.
Abstract
Коррелятивная световая и электронная микроскопия (КЛЭМ) — это комплексная микроскопия, которая сочетает в себе информацию о локализации, полученную с помощью флуоресцентной микроскопии (ФМ), и контекст клеточной ультраструктуры, полученной с помощью электронной микроскопии (ЭМ). CLEM — это компромисс между флуоресценцией и ультраструктурой, и обычно ультраструктура нарушает флуоресценцию. По сравнению с другими гидрофильными смолами, такими как глицидилметакрилат, HM20 или K4M, Epon превосходит по свойствам сохранения ультраструктуры и секционирования. Ранее мы продемонстрировали, что mEosEM может выживать при фиксации тетраоксида осмия и встраивании эпона. Используя mEosEM, мы впервые добились поствстраивания Epon CLEM, который поддерживает флуоресценцию и ультраструктуру одновременно. Здесь мы приводим пошаговую информацию о подготовке ЭМ-образца, ФМ-визуализации, ЭМ-визуализации и выравнивании изображения. Мы также усовершенствовали процедуры идентификации одной и той же клетки, визуализированной с помощью ФМ-визуализации, во время ЭМ-визуализации и детализировали регистрацию между ФМ и ЭМ изображениями. Мы полагаем, что с помощью этого нового протокола можно легко получить коррелятивную световую и электронную микроскопию Epon после встраивания в традиционные ЭМ-установки.
Introduction
Флуоресцентная микроскопия (ФМ) может быть использована для определения локализации и распределения белка-мишени. Тем не менее, контекст, который окружает целевой белок, теряется, что имеет решающее значение для тщательного изучения целевого белка. Электронная микроскопия (ЭМ) имеет высочайшее разрешение изображения, предоставляя несколько субклеточных деталей. Тем не менее, у EM отсутствует маркировка мишеней. Благодаря точному слиянию флуоресцентного изображения, полученного с помощью ФМ, с серым изображением, полученным с помощью ЭМ, коррелятивная световая и электронная микроскопия (КЛЭМ) может объединить информацию, полученную этими двумя режимами визуализации 1,2,3,4.
CLEM — это компромисс между флуоресценцией и ультраструктурой1. Из-за ограничений современных флуоресцентных белков и традиционных процедур подготовки образцов для ЭМ, особенно с использованием осминовой кислоты (OsO4) и гидрофобных смол, таких как Epon, ультраструктура всегда нарушает флуоресценцию5. OsO4 является незаменимым реагентом при подготовке образцов для ЭМ, который используется для повышения контрастности ЭМ-изображений. По сравнению с другими смолами для встраивания, Epon превосходит его по сохранению ультраструктуры и свойствам секционирования5. Однако ни один флуоресцентный белок не может удерживать флуоресцентный сигнал после обработки OsO4 и встраивания Epon6. Для преодоления ограничений, накладываемых флуоресцентными белками, был разработан метод предварительного встраивания КЛЕМ, при котором ФМ-визуализация проводится перед подготовкой ЭМ-образца6. Однако недостатком предварительного встраивания CLEM является неточная регистрация между FM и EM изображениями5.
Напротив, метод КЛЭМ после встраивания выполняет ЧМ-визуализацию после подготовки ЭМ образца, точность регистрации которой может достигать 6-7 нм 5,6. Для сохранения флуоресценции флуоресцентных белков использовали очень низкие концентрации OsO4 (0,001%)3 или методы получения ЭМ 4,7 с замораживанием под высоким давлением (HPF) и замораживанием (FS) 4,7 за счет нарушения ультраструктуры или контрастности ЭМ-изображения. Разработка mEos4b в значительной степени способствует прогрессу после встраивания CLEM, хотя в качестве встраивающей смолы используется глицидилметакрилат5. С развитием mEosEM, который может выдерживать окрашивание OsO4 и встраивание Epon, впервые был достигнут CLEM сверхвысокого разрешения после встраивания Epon, сохраняющий флуоресценцию и ультраструктуру одновременно6. После mEosEM было разработано несколько флуоресцентных белков, которые могут пережить окрашиваниеOsO4 и встраивание эпона 8,9,10,11. Это в значительной степени способствует развитию CLEM.
Существует три ключевых аспекта Epon после встраивания CLEM. Во-первых, это флуоресцентный белок, который должен поддерживать флуоресцентный сигнал после подготовки ЭМ-образца. Согласно нашему опыту, mScarlet превосходит другие флуоресцентные белки. Во-вторых, как найти ту же самую клетку, которую визуализирует ФМ-визуализация при ЭМ-визуализации. Чтобы решить эту проблему, мы усовершенствовали процедуру этого шага, чтобы можно было легко найти целевую клетку. Последним является метод выравнивания FM-изображения с электромагнитным изображением. Здесь мы подробно опишем регистрацию между FM и EM изображениями. В этом протоколе мы экспрессируем mScarlet в нейронах VGLUT2 и демонстрируем, что mScarlet может нацеливаться на вторичные лизосомы с помощью Epon после встраивания CLEM. Мы предоставляем пошаговую информацию для Epon после встраивания CLEM без ущерба для флуоресценции и ультраструктуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный здесь протокол представляет собой универсальный метод визуализации, который может сочетать информацию о локализации белка-мишени из световой микроскопии (ЛМ) и контекст, окружающий белок-мишень из электронной микроскопии (ЭМ)6. В связи с ограничениями, прис…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (32201235 Zhifei Fu), Фондом естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (2022J01287 Zhifei Fu), Исследовательским фондом передовых талантов при Фуцзяньском медицинском университете, Китай (XRCZX2021013 Zhifei Fu), Финансовым специальным научным фондом провинции Фуцзянь, Китай (22SCZZX002 Zhifei Fu), Основание Ключевой лаборатории технической оценки регуляции фертильности нечеловекообразных приматов NHC и Фуцзяньской больницы материнства и здоровья ребенка (2022-NHP-04 to Zhifei Fu). Мы благодарим Линьин Чжоу, Минся Ву, Си Линя и Янь Ху из Центра обслуживания государственных технологий Фуцзяньского медицинского университета за помощь в подготовке образцов для ЭМ и ЭМ-визуализации.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
