Summary

פילמור שני פוטונים הדפסה תלת-ממדית של התקני תרבית תאים עצביים בקנה מידה מיקרוני

Published: June 07, 2024
doi:

Summary

הדפסה תלת ממדית בקנה מידה מיקרומטרי מאפשרת אב טיפוס מהיר של התקנים פולימריים עבור תרביות תאים עצביים. כהוכחה עקרונית, קשרים מבניים בין נוירונים הוגבלו על ידי יצירת מחסומים וערוצים המשפיעים על צמיחת נוירוטים, בעוד שההשלכות התפקודיות של מניפולציה כזו נצפו על ידי אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית.

Abstract

תרביות נוירונים היו מודל ניסיוני ייחוס במשך כמה עשורים. עם זאת, סידור תאים תלת-ממדי, אילוצים מרחביים על צמיחת נוירוטים וקישוריות סינפטית מציאותית חסרים. זה האחרון מגביל את המחקר של מבנה ותפקוד בהקשר של מידור ומקטין את המשמעות של תרבויות במדעי המוח. קירוב ex vivo הסידור האנטומי המובנה של קישוריות סינפטית אינו טריוויאלי, למרות היותו המפתח להופעת מקצבים, פלסטיות סינפטית, ובסופו של דבר, פתופיזיולוגיה של המוח. כאן, פילמור שני פוטונים (2PP) משמש כטכניקת הדפסה תלת-ממדית, המאפשרת ייצור מהיר של התקני תרבית תאים פולימריים באמצעות פולידימתיל-סילוקסאן (PDMS) בקנה מידה מיקרומטרי. בהשוואה לטכניקות העתק קונבנציונליות המבוססות על מיקרופוטוליטוגרפיה, הדפסה בקנה מידה זעיר 2PP מאפשרת תפנית מהירה ומשתלמת של אבות טיפוס. פרוטוקול זה מדגים את התכנון והייצור של התקנים מיקרופלואידים מבוססי PDMS שמטרתם לטפח רשתות נוירונים מודולריות. כהוכחה עקרונית, התקן דו-תאי מוצג כדי להגביל פיזית את הקישוריות. באופן ספציפי, צמיחה אקסונלית אסימטרית במהלך התפתחות ex vivo מועדפת ומותרת להיות מכוונת מחדר אחד למשנהו. על מנת לחקור את ההשלכות התפקודיות של אינטראקציות סינפטיות חד-כיווניות, נבחרים מערכי מיקרואלקטרודות מסחריים לניטור הפעילות הביו-חשמלית של מודולים עצביים מחוברים. כאן, שיטות 1) לייצר תבניות עם דיוק מיקרומטר 2) לבצע הקלטות חוץ תאיות במבחנה multisite בתרבויות נוירונים קליפת המוח חולדה מודגמים. על ידי הפחתת עלויות ונגישות נרחבת עתידית של הדפסה תלת-ממדית 2PP, שיטה זו תהפוך לרלוונטית יותר ויותר במעבדות מחקר ברחבי העולם. במיוחד בתחום הנוירוטכנולוגיה ורישום נתונים עצביים בעלי תפוקה גבוהה, הקלות והמהירות של אבות-טיפוס המפושטים במודלים חוץ-גופיים ישפרו את הבקרה הניסויית ואת ההבנה התיאורטית של מערכות עצביות בקנה מידה גדול in vivo .

Introduction

חקירת הפעילות העצבית באורגניזמים מתנהגים מציבה מספר אתגרים. לדוגמה, הגישה הפיזית לרקמת המוח מוגבלת על ידי הצורך לשמור על שלמותה, ולכן האזורים השטחיים של המוח נחשבים בקלות רבה יותר. בידוד מטרות ספציפיות בתוך הרקמה השלמה הוא לעתים קרובות משימה מרתיעה ולפעמים בלתי אפשרית. למרות שתרביות נוירונים הומוגניות מנותקות מציעות גישה נוחה לתכונות המולקולריות, הביוכימיות והביופיזיקליות של רכיבים בודדים (תת-תאיים) של מעגל עצבי, קישוריות מציאותית וארגון אנטומי של המוח השלם הולכים לאיבוד. אילוצים בסיסיים אלה היוו השראה למאמצי המחקר להשיג דרך ביניים, שבה נמנעת מורכבות in vivo בעוד שניתן לבנות את המבנה במבחנה, שהוא לפי דרישה 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . בפרט, תרבויות נוירונים מודולריות היו נושא למחקר מקיף בעשורים האחרונים, במטרה להתמודד עם שאלות מפתח של פיזיולוגיה של המוח כמתואר להלן.

ארגון: מחקרי In vivo מראים כי המוח בנוי אנטומית בשכבות עם סוגי תאים מדויקים ומערכי הקרנות. בדיקות פונקציונליות חשפו את ארגון הרשתות העצביות במכלולי צמתים ומודולים, עם סכימות קישוריות מדויקות10,11. עם זאת, תפקידם של מוטיבים של קישוריות ומיקרו-מעגלים אינו יכול להיחקר כראוי in vivo בשל המספר העצום של סינפסות המעורבות, כמו גם ההשפעות השזורות של התפתחות ופלסטיות תלוית פעילות.

העברת אותות: בתרבויות in vivo או אקראיות במבחנה , זה מאתגר להעריך העברת אותות. בחינת ההולכה האקסונלית ופוטנציאל הפעולה לאורכה מחייבת הנחיית צמיחת נוירוט על ידי תפקוד פני השטח או דפוסים כימיים, מתן יחס אות לרעש גבוה בקריאות חוץ-תאיות של פעילות חשמלית12.

רלוונטיות תרגומית: פענוח התפקיד הבלעדי של אלמנטים קדם-סינפטיים לעומת פוסט-סינפטיים על פני תנאים פתולוגיים דורש גישה לאלמנטים אלה בנפרד. תרבויות מודולריות עם קישוריות מוגבלת, המפרידה ביעילות את האלמנטים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים, הן כלים חיוניים למטרה זו13.

קיימות מספר שיטות להשגת צורה כלשהי של מבנה בתרבות העצבית. ניתן לסווג אותם באופן רחב כמניפולציה כימית ופיזיקלית על פני השטח9. השיטות הראשונות 14,15 מסתמכות על הנטייה של תאים עצביים להיצמד לתרכובות (ביו)כימיות מסוימות. זה דורש הפקדת מולקולות דביקות או מושכות על משטח בדיוק בקנה מידה מיקרו ומעקב אחר תבנית מפורטת. בעוד שזה מאפשר כיסוי חלקי של פני השטח של התאים, בעקבות הדפוס הרצוי, שיטות כימיות מוגבלות מטבען ויש להן שיעור הצלחה נמוך יחסית בהנחיית גדילה של נוירוטים16. שליטה מלאה בכיווניות האקסון מחייבת יצירת שיפוע מרחבי של כימיקלים אד-הוק כדי לעצב הנחיה אקסונלית17. השיטות האחרונות כרוכות במניפולציה פיזית על פני השטח ומשמשות בדרך כלל לבניית הרשתות העצביות במבחנה. תאי עצב מוגבלים פיזית במקומות הרצויים על ידי כליאה גיאומטרית, כגון תאים מיקרוסקופיים, קירות, תעלות וכו ‘, המעצבים פולימר תואם ביולוגית כגון polydimethylsiloxane (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 נרפא והתמצק למכשיר מיקרופלואידי. השיטה דה פקטו לייצור מיקרופלואידים PDMS היא פוטוליתוגרפיה רכה21, שבה מסכה דו-ממדית מעוצבת בקנה מידה מיקרו ומשמשת לחריטה סלקטיבית של חומר מבוסס סיליקון בחשיפה לקרינת UV. על קצה המזלג, שרף הניתן לריפוי UV (כלומר, photoresist) מצופה על פרוסת סיליקון באמצעות ציפוי סיבוב, ומגיע לגובה מסוים שנקבע על ידי צמיגותו ומהירות הסיבוב שלו. לאחר מכן, המסכה עם הדוגמה ממוקמת מעל התנגדות האור ונחשפת לאור UV. אזורים שקופים בתוך המסכה, המתאימים לאזורי עניין, יאפשרו לאור UV לגרום להצלבה מקומית של מולקולות הפוטו-התנגדות. האזורים של photoresist לא חשוף נשטפים באמצעות ממס, וכתוצאה מכך היווצרות של תבנית אב. זה משמש שוב ושוב כדי לאפות אלסטומר של הבחירה (כלומר, PDMS), אשר לאחר מכן חרוט עם הגיאומטריות הרצויות בכמה עותקים רצויים. שיטת ייצור כזו היא השיטה הנפוצה ביותר לייצר התקנים מיקרופלואידים22. אולי המגבלות העיקריות של פוטוליתוגרפיה רכה הן תנאי מוקדם להשקעות הון בולטות וחוסר ההיכרות של מעבדות ביולוגיות עם הטכניקות והמומחיות הנדרשות. הכנת המסכה ושלבי הפוטוליתוגרפיה הרכה הנדרשים לתכנון גיאומטריות מורכבות של יחס גובה-רוחב גבוה מרובה גבהים אינן טריוויאליות23 ולעתים קרובות דורשות מיקור חוץ. למרות שהוצעו שיטות חלופיות ודלות תקציב, הן לא תמיד עונות על דרישות הדיוק הגבוהות של אב טיפוס ביולוגי24.

כאן מוצגת שיטת ייצור חלופית, המסתמכת על פילמור שני פוטונים (2PP) וייצור תוספים. זה פשוט ואינו דורש כשלעצמו מומחיות מתקדמת במיקרו-פבריקציה ומיקרופוטוליטוגרפיה. תחום המחקר של מיקרו-ייצור 2PP הופיע בסוף שנות ה-9025, ומאז הוא עד לצמיחה אקספוננציאלית26. עוד על עקרונות היסוד של טכניקה זו ניתן למצוא במקום אחר26. בקצרה, על ידי מיקוד דחף האור העירור במרחב תלת ממדי, 2PP ממנף את התלות הלא ליניארית של בליעת מולטיפוטונים בעוצמה. זה מעניק את היכולת של ספיגה מוגבלת, ומבטיח עירור מדויק וסלקטיבי בתוך אזורים מקומיים מאוד. בעיקרו של דבר, התנגדות אור בגוון שלילי, חומר עם מסיסות מופחתת בחשיפה לאור, נתון לקרן ממוקדת של פעימות לייזר פמטו-שניות במחזור עבודה נמוך27. זה מאפשר דחפים בעוצמות גבוהות בעוצמות ממוצעות נמוכות, מה שמאפשר פילמור מבלי לפגוע בחומר. האינטראקציה של מונומרים רדיקליים המושרים על ידי אור מולידה אוליגומרים רדיקליים, המתחילים פילמור המשתרע לאורך כל הפוטו-התנגדות עד לנפח מובחן, כלומר ווקסל, שגודלו תלוי בעוצמת ומשך פעימות הלייזר28.

בעבודה זו מוצגים שני מרכיבים: A) תכנון וייצור מהיר של תבנית מודפסת בתלת-ממד, הניתנת לשימוש חוזר פעמים רבות כדי לייצר התקנים חד-פעמיים של תרביות תאים עצביים פולימריים (איור 1), ו-B) הצימוד המכני שלהם על פני השטח של מצעי תרבית תאים עצביים מישוריים, או אפילו של מערכי מיקרואלקטרודות משולבי מצע המסוגלים להקליט אותות ביואלקטריים מרובי אתרים.

תכנון בעזרת מחשב של מודל מכני תלת ממדי מתואר כאן בקצרה רבה ומלווה בשלבים המובילים לתבנית מודפסת בתלת-ממד וייצור מכשירי PDMS מפורט גם הוא.

ניתן להשתמש במגוון יישומי תוכנת תכנון בעזרת מחשב כדי ליצור את מודל האובייקטים התלת-ממדי ההתחלתי ולייצר קובץ STL כדי לשלוט בתהליך ההדפסה הדו-PP. בתוך טבלת החומרים, היישומים הראשונים והאחרונים המפורטים הם ללא תשלום או מסופקים עם רישיון חינם. בניית מודל תלת-ממדי דורשת תמיד יצירת סקיצה דו-ממדית, אשר לאחר מכן מושחלת בשלבי המידול הבאים. כדי להדגים רעיון זה, תהליך תכנון תוכנת CAD תלת מימדי גנרי מודגש בסעיף הפרוטוקול, המוביל למבנה העשוי מקוביות חופפות. לקבלת מידע מקיף יותר, מספר הדרכות מקוונות ומשאבי הדרכה ללא תשלום זמינים, כפי שמצוין בטבלת החומרים.

קובץ STL שנוצר מתורגם לאחר מכן לסדרה של פקודות שיבוצעו על-ידי מדפסת התלת-ממד (כלומר, הליך חיתוך). עבור מדפסת תלת-ממד 2PP ספציפית בשימוש, התוכנה DeScribe משמשת לייבוא קובץ STL ולהמרתו לפורמט הקנייני General Writing Language (GWL). הצלחת תהליך הדפסת 2PP תלויה בפרמטרים שונים, ובראשם עוצמת הלייזר ומהירות הסריקה, תפירה ומרחקי בקיעה-חיתוך. הבחירה של פרמטרים אלה, יחד עם הבחירה של אובייקטיבי photoresist, תלוי בתכונות הקטנות ביותר של העיצוב, כמו גם את היישום המיועד. לפיכך, אופטימיזציה של פרמטרים הופכת חיונית כדי לעמוד בדרישות של תרחישי עיצוב שונים ומקרי שימוש. עבור עבודה זו, המתכון המומלץ IP-S 25x ITO מעטפת (3D MF) נחשב כתצורה עבור פרמטרי ההדפסה. בסופו של דבר, חלק מודפס יציב מכנית מודפס ברזולוציה הדרושה תוך מזעור זמן ההדפסה התלת-ממדית שלו.

עיצוב התבנית וקובץ STL הקשור אליו, שהודגם בעבודה זו, מורכב ממסגרת ריבועית להפרדת החלל של תרבית תאים בשני תאים: אזור חיצוני (כלומר, ייקרא מקור לאחר מכן) ואזור פנימי (כלומר, ייקרא טארגט לאחר מכן). שני תאים אלה מחוברים באמצעות קבוצות של מיקרו-ערוצים, שכל אחד מהם מאופיין בגבולות חדים, שנועדו לעכב באופן ספציפי את צמיחת הנוירונים מהמטרה למקור, אך לא להיפך, וככאלה לקדם קישוריות סינפטית כיוונית בין תאי עצב הגדלים בשני האזורים.

מחקרים קודמים השתמשו בגיאומטריות שונות של מיקרו-ערוצים כדי לעודד צמיחה כיוונית של נוירוטים. דוגמאות לכך כוללות צורות משולשות18, מבני גדרות ערוץ19 ותעלות מחודדות20. כאן נעשה שימוש בעיצוב הכולל מחסומי זווית חדים מעבר לגבולות המיקרו-ערוץ, המאופיינים גם בכניסות א-סימטריות. מיקרו-ערוצים אלה משמשים ליצירת המשכיות בין תא סגור, תא המטרה, לבין האזור החיצוני, תא המקור. צורת המשפך של החלק הראשוני של המיקרו-ערוצים, מצד המקור, נועדה לקדם את היווצרותם של צרורות אקסונליים ואת צמיחתם לאורך הנתיב הקצר ביותר, כלומר קו ישר, המחבר בין המקור למטרה. למרחב המשולש הממומש על ידי עמידה מול זוויות חדות יש נפח גדול יותר בצד המטרה כדי לכוון לעיכוב יעיל של נתיבי העצבים תוך העדפת הירי המהיר של צרורות שמקורם במקור ובכיבוש של השטח הפנוי. הבחירה של 540 מיקרומטר לאורך המיקרו-ערוצים מסננת ביעילות את הצמיחה הדנדריטית הקצרה יותרבדרך כלל 39. בנוסף, גובהם 5 מיקרומטר מונע מסומטה התא לחדור דרך המיקרו-ערוצים. בסך הכל, תצורה זו הוכיחה את עצמה כמקדמת קישוריות חד-כיוונית בין מודולי היעד החיצוניים, המקוריים והפנימיים, והיא מוצגת כאן כהוכחה עקרונית בין האפשרויות החלופיות הרבות.

בעוד שהתקני PDMS, המיוצרים על ידי תבנית 2PP, יכולים להיות מחוברים לפני השטח של מצעי תרבית תאים נפוצים, כגון כיסויי זכוכית או צלחות פטרי, בעבודה זו נעשה שימוש במערכי מיקרואלקטרודות משולבים במצע מסחרי. לא נעשה כל מאמץ לייעל את התכנון התלת-ממדי למערך המיקרואלקטרודות, והצימוד המכני בוצע תחת הנחיית סטריאומיקרוסקופיה שמטרתה הייתה רק למקם את המכשיר על פני המערך, תוך השארת חלק מהמיקרואלקטרודות חשופות בשני הצדדים, המקור והמטרה. זה מאפשר הערכה ראשונית של ההשלכות התפקודיות של הקישוריות המוגבלת בתרביות תאים עצביים.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם לחוקים האירופיים והאיטלקיים (דירקטיבת הפרלמנט האירופי והמועצה מיום 22 בספטמבר 2010 [2010/63/EU]; צו ממשלתי איטלקי מיום 4 במרץ 2014, מס ’26), אושרו במפורש על ידי ה- OpBA המוסדי (הוועדה לטיפול בבעלי חיים) ב- Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati ואושרו רשמית על ידי משרד הבריאות האיטלקי (Auth. No. 22DAB. נ.UVD). אלה הובילו לזמינות של חומר לא רגיש מרקמת המוח של החולדה שהושתלה, שישמש לאימות ניסיוני של השיטה שהוצגה בעבודה זו. 1. 3D ייצור עובש על ידי פילמור שני פוטונים יצירת קבצי CADהערה: השלבים הבאים מדגימים זרימת עבודה כללית של עיצוב תלת-ממדי, תוך שימוש בתוכנת תכנון בעזרת מחשב (כלומר, SolidWorks). קובץ עיצוב STL לדוגמה המתואר בעבודה זו (איור 2) זמין כקובץ קידוד משלים 1, וכן באמצעות Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).הפעל את יישום שולחן העבודה של תוכנת העיצוב בעזרת מחשב. בשורת התפריטים העליונה, בחר חדש. מתוך האפשרויות, בחר חלק: ייצוג תלת-ממדי של רכיב עיצוב יחיד. לחץ על צירוף המקשים Ctrl + 5 כדי ליצור את התצוגה העליונה של השרטוט. בחלונית הצדדית, בחרו ‘שרטוט ‘ ובחרו ‘ מלבן פינתי’. בחר קצה אחד של המלבן על ידי לחיצה עליו. כשחלונית פרמטרים מופיעה, הגדר את האורך ל- 100 יחידות. חזור על שלב 1.1.3 עבור הקצה בניצב לקודם: הגדר את אורכו ל- 50 יחידות. בחר את המלבן על-ידי גרירה מעליו תוך החזקת לחצן העכבר השמאלי. בתפריט ‘הוסף יחס’ , בחר ‘תקן’ כדי להגביל את היחסים בין השורות. צא מהסקיצה וחזור על שלבים 1.1.3 עד 1.1.5, תוך יצירת מלבן חדש (קטן יותר), החופף לשרטוט הקודם. בחלונית הצדדית, בחרו ‘תכונות’ ובחרו ‘בוס/בסיס’: קבעו את עומק המלבנים הגדולים והקטנים ל-5 ו-10 יחידות, בהתאמה. בתפריט קובץ , שמור את החלק בתבנית STL (כלומר, שפת טסלציה סטנדרטית). עיבוד קבצי CADהעבר את קובץ STL למחשב אישי, מצויד בתוכנת היישום DeScribe. הפעל את Describe ומתפריט File שלו, פתח את קובץ STL. יופיע ייצוג תלת ממדי של המודל. ממקטע הכיוון בתפריט הימני, סובבו את הדגם כדי לכוון אותו בהתאם במרחב, ומרכזו אותו במישור. התאם את קנה המידה הכולל על-ידי בחירת המקטע שינוי קנה מידה בתפריט הימני. מהתפריט הנפתח בחלק העליון, בחר את מתכון IP-S 25x ITO Shell (3D MF). זה מציין IP-S כהתנגדות לצילום, פי 25 לעוצמת ההגדלה של המטרה, מצע מצופה תחמוצת בדיל אינדיום (ITO) כמצע הדפסה, והדפסת מעטפת ופיגומים כמצב הפעלה עם תכונות בגודל בינוני (MF). נווט באשף, בחר והגדר מרחק חיתוך ל- 1 מיקרומטר ומרחק בקיעה ל- 0.5 מיקרומטר הן עבור המעטפת והן עבור הפיגומים. בשלב הפלט של אשף הייבוא, תחת פיצול, הגדר את גודל הבלוק כ- X = 200 מיקרומטר, Y = 200 מיקרומטר ו- Z = 265 מיקרומטר ואת הסטת הבלוק כ- X = 133 מיקרומטר, Y = 133 מיקרומטר ו- Z = 0, כדי להבטיח שהמבנים העדינים של המיקרו-ערוצים לא יושפעו מקווי התפרים. במצב סריקה, השתמש בברירת המחדל: Galvo עבור מישור X-Y ו- Piezo עבור ציר Z. הקש Save ובתפריט הטקסטואלי הבא, החלף את השורה var $baseLaserPower = $shellLaserPower ב- var $baseLaserPower = 75, כדי להפחית ל- 75% את עוצמת הלייזר בשכבה הנמוכה ביותר של ההדפסה. העבר את קבצי GWL שהתקבלו על ידי השלבים לעיל לתחנת העבודה הייעודית להדפסת תלת מימד 2PP. הדפסה תלת מימדית ופיתוח דוגמאותהפעל את תוכנת היישום NanoWrite . לאחר אתחול המדפסת, לחץ על Exchange Holder בממשק התוכנה, כדי להכניס את מחזיק המצע ולהרכיב את המטרה. הרכיבו את המטרה 25x במיקום המתאים על האף. זהה איזה צד של מצע הזכוכית מצופה ב- ITO, על ידי מולטימטר אלקטרוני המוגדר למדידת התנגדויות: הקריאה צריכה להיות בערכים נמוכים, כגון 100-300 Ω, אך רק עבור הצד המצופה ITO. מקמו את מצע הזכוכית על המחזיק, וכוונו את הצד המצופה ITO כלפי מעלה. השתמש בסרט הדבקה כדי להחזיק אותו היטב במקומו. מתחת למכסה האדים הכימיים, יש למרוח טיפה של התנגדות פוטו-התנגדות IP-S במרכז מצע הזכוכית. הכנס את המחזיק למדפסת התלת-ממד, כאשר טיפת השרף פונה למטרה (כלומר, כלפי מטה). דרך תפריט קובץ התוכנה, טען את קבצי GWL. בחר Approach Sample, כדי להזיז את המטרה קרוב לטיפת השרף. בחר Find Interface כדי לאפשר זיהוי של ממשק ההדפסה ITO-photoresist, בהתבסס על הפרש אינדקס השבירה של שני החומרים. בחר התחל משימה כדי להפעיל את ההדפסה. בסיום ההדפסה, הקש Exchange Holder כדי לאחזר את המחזיק. אחזר את המחזיק והסר בעדינות את המצע עם החלק המודפס. השקיעו את מצע הזכוכית בפרופילן גליקול מתיל אתר אצטט (PGMEA) למשך 20 דקות מתחת למכסה האדים, כדי לפתח את החלק המודפס. מוציאים את המצע מ-PGMEA וטובלים אותו באיזופרופנול למשך 5 דקות. הניחו לחלק המודפס להתייבש באוויר, מתחת למכסה האדים הכימיים. טיפול לאחר הדפסה והרכבה על עובשרפא את החלק המודפס על ידי חשיפה לאור UV (כלומר, 365-405 ננומטר) בעוצמה מספקת למשך 5-20 דקות (ראה דיון לפרטים על הספק). מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית, הסר בעדינות את החלק המודפס ממצע הזכוכית. זרוק ~ 2 μL של שרף לתחתית צלחת פטרי בגודל 35 מ”מ x 10 מ”מ. מקמו בזהירות את החלק המודפס מעל הטיפה ותנו לשרף לזרום מתחת לחלק. מרפא עוד יותר את החלק המודפס על ידי חשיפה לאור UV, למשך 5 דקות. מכסים את צלחת הפטרי עם המכסה שלה ומעבירים אותה לתנור לריפוי חום, מעל 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס. אין לחמם את התנור מראש כדי למנוע עיוות או שבר של החלק המודפס. לאחר הריפוי, החלק המודפס יהיה מחובר לצמיתות לתחתית צלחת הפטרי. מעתה, החלק המודפס והמותקן ייקרא עובש. 2. ייצור מכשיר PDMS ממצעי העובש ותרבית התאים ייצור מכשירי PDMSהכינו 20 מ”ל של תערובת 10:1 (יחס משקל) של הבסיסוסוכן הריפוי של PDMS לא פולימרי. עבור כל מכשיר, ובהתאם לגובה הנדרש שלה, 1-2 מ”ל של תערובת PDMS מספיק. אחסנו את עודפי PDMS הלא פולימריים בטמפרטורה של -20°C לשימוש מאוחר יותר. מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית, ערבבו היטב את התערובת במשך 4 דקות. כאשר התערובת לוכדת בועות אוויר באופן שווה, היא תהפוך אטומה. מעבירים את התערובת לתוך צינור 50 μL וצנטריפוגות אותו במהירות 168 x גרם למשך 5 דקות, כדי לסלק בועות אוויר מהתערובת ולהשיג מראה ברור. טפלו בתבנית עם 10 מיקרוליטר של חומר הידרופובי (כלומר, Repel-silane ES) ואפשרו לה לנוח במשך 7 דקות, מה שמבטיח ניתוק חלק של PDMS פולימרי מהתבנית בהמשך. שטפו את העובש פעם אחת עם 70% אתנול, ופעמיים עם מים נטולי יונים. הניחו לתבנית להתייבש באוויר מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. יוצקים בעדינות את תערובת PDMS על התבנית, עד שמגיעים לגובה הסופי המיועד של המכשיר. למניעת היווצרות בועות אוויר, יוצקים את התערובת בעדינות וממרחק קרוב לפני השטח של התבנית. מכסים את התבנית ומעבירים למשך 18 דקות לתנור שחומם מראש והתייצב על 80 מעלות צלזיוס, לריפוי. עבור גובהי המכשיר העולים על 5 מ”מ ועד 1 ס”מ, הארך את זמן הריפוי מ- 18 ל- 25 דקות. מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, נתקו בעדינות את גוש ה-PDMS שנרפא מהתבנית וטבלו אותו באיזופרופנול למשך 10 דקות לפחות, בתוך צלחת פטרי מזכוכית. איזופרופנול מבטל PDMS לא מוצלב. שמור תמיד על בלוק PDMS מכוסה. חדשו את האיזופרופנול, ותחת מיקרוסקופ סטריאופוני, חתכו בזהירות את החלק המרובע המרכזי של המכשיר (המזוהה כאזור המטרה, בעבודה זו) על ידי סכין דקירה אופתלמית. לאחר מכן, המשך לחתוך עוד לאורך הקצוות כדי להשיג את הצורה הסופית של המכשיר. אחזר את המכשיר מאיזופרופנול והטביע אותו באתנול למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטוף אותו 3 פעמים במים DI סטריליים. שמרו על סטריליות מנקודה זו ואילך. מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית, העבירו את המכשיר לצלחת פטרי חדשה, תוך השארת הפקק פתוח מעט. הניחו לו להתייבש לחלוטין באוויר. הרכבה של מכשירים והכנת מצעי תרבית תאים.יש לעקר כל מערכי מיקרואלקטרודות (MEAs) על ידי טבילה באתנול 70% למשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותו 3x במים סטריליים DI. באמצעות פינצטה סטרילית עדינה, תחת מכסה מנוע זרימה למינרית וסטריאומיקרוסקופ, הרכיבו את התקן PDMS על האזור הפנימי של MEA. ישרו צד אחד של התקן PDMS למרכז אזור MEA הפנימי, הכולל מיקרואלקטרודות משולבות מצע, כך שמעט מיקרואלקטרודות יישארו חשופות הן מאזור המקור והן מאזור היעד (ראו איור 2).הערה: עבור עבודה זו, אין צורך ליישר מיקרואלקטרודות MEA למיקרו-ערוץ של התקן PDMS. ייתכן שתידרש דחיפה עדינה על המכשיר כדי להשיג אטימה הדוקה בין התקן PDMS לבין משטח MEA. הימנעו בכל מחיר מלגעת במיקרואלקטרודות בקצה הפינצטה. הכנס את MEA עם התקן PDMS עליו לתוך תא ניקוי הפלזמה, כדי להפעיל את הפעלת פני השטח באמצעות פלזמה אוויר. התחל את התהליך עם פינוי משאבת ואקום של 4 דקות של החדר. לאחר מכן, פתח מעט את שסתום האוויר כדי לאפשר דימום אוויר מבוקר. סגור את שסתום האוויר והפעל את השראות הפלזמה, תוך התאמת רמת הספק RF בין 10 W ל- 18 W. ברגע שאור זוהר מופיע, תן לתהליך לרוץ במשך 80 שניות. לאחר מכן, כבה את משדר הפלזמה, סגור את שסתום משאבת הוואקום ופתח בעדינות את שסתום האוויר. פתח את התא כדי לאחזר את MEA.הערה: אם הטיפול בפלזמה כרוך בחשיפת MEAs לסביבה לא סטרילית, הניחו כל MEA תחת אור UV במכסה מנוע זרימה למינרית למשך 30 דקות, כדי להבטיח את הסטריליות. הוסף 1 מ”ל של תמיסת פוליאתילנימין (PEI) 0.1% wt/vol לאזור המזרח התיכון וצפון אפריקה ודגור עליו ב-37°C למשך הלילה. שאפו את תמיסת PEI ושטפו במים סטריליים DI פי 5. הוסיפו 1 מ”ל ממדיום תרבית התאים לאזור המזרח התיכון וצפון אפריקה ודגרו עליו לפני זריעת התאים. 3. תרבית תאים עצבית ואלקטרופיזיולוגיה הכינו מראש את אמצעי הדיסקציה, את תמיסת העיכול ואת התמיסות 1-3 (ראו טבלה 1). תרבית תאים עצבית מנותקת.אחזו בעדינות בגור עכברושי וויסטאר ילודים בן 0-1 ימים ליד החוטם ובצעו עריפת ראש מהירה באמצעות זוג מספריים חדים. מקלפים את עור הקרקפת, מבצעים חתך לאורך קו האמצע של הגולגולת באמצעות מספריים עדינים, ולאחר מכן יוצרים חתך קורונלי דרך הגולגולת בצומת המוח הקטן. מוציאים את הגולגולת, מוציאים את המוח עם מרית עדינה ומעבירים אותה למדיום דיסקציה קר (4 מעלות צלזיוס). הסר את הרקמה התת-קליפתית, ההיפוקמפוס וקרומי המוח. טוחנים את הרקמה לחתיכות קטנות (כלומר, 1-2 מ”מ3) ומעבירים אותם בצינור של 15 מ”ל. יש להשליך את התמיסה ולשטוף את הרקמה באמצעות מדיום דיסקציה טרי, ולאחר מכן לשטוף עם מדיום העיכול. השליכו את מדיום העיכול ולאחר מכן הוסיפו 1 מ”ל של תמיסה 1. דוגרים על התערובת ב-37°C למשך 5 דקות. יש להשליך תמיסה 1 ולשטוף את הרקמה באמצעי דיסקציה טרי. לאחר מכן להוסיף 1 מ”ל של תמיסה 2 ולשמור את התערובת במשך 10 דקות ב 4 °C. יש להשליך את תמיסה 2 ולשטוף את הרקמה באמצעות מדיום דיסקציה טרי. לאחר מכן הוסף 1 מ”ל של פתרון 3. נתקו מכנית את התאים על ידי פיפטציה איטית למעלה ולמטה של התמיסה 20 עד 30 פעמים. כאשר מופיעה תערובת עכורה אחידה של תאים מנותקים, הגדל את נפחה ל -3 מ”ל על ידי הוספת מדיום דיסקציה. לאסוף את גלולת התא על ידי צנטריפוגה של התערובת ב 100 x גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-1 מ”ל של מדיום תרבית שחומם מראש. ספירת תאים (כלומר, על ידי תא ספירת תאים) והתאמת צפיפות תמיסת זריעת התאים בהתאם. זרעו כל MEA עם 1 מ”ל של תמיסת זריעה עם צפיפות תאים נומינלית של 1.8 x 106 (~ 6500 תאים / מ”מ2). לדגור על MEAs זרעים באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2. החליפו את המדיום במדיום תרבית טרי (כלומר, מיוצר מדי שבוע) כל יומיים. אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאיתהערה: תרביות תאים עצביים מנותקות מגיעות לפנוטיפ חשמלי בוגר לחלוטין לאחר 2-3 שבועות במבחנה. הסעיפים הבאים מתארים פרוטוקול גירוי חוץ-תאי המשתמש בתוכנת יישום MEA מסחרית (Experimenter) כדי לגרות חשמלית אחת מאוכלוסיות תאי העצב המתורבתות במודולים, כלומר מקור או מטרה, ובו זמנית לתעד את הפעילות של שתי האוכלוסיות, ברשתות בוגרות.הרכיבו בעדינות MEA אחד בתוך הראש של המגבר האלקטרוני הרב-ערוצי, בתוך אינקובטור יבש (37°C, 5% CO2) ואפשרו לו להכיל למשך 10 דקות. ניתן לייצר מכסה PDMS מותאם אישית בנפרד ולהשתמש בו ככיסוי הדוק לכל MEA, כדי להפחית אידוי מים ולשמור על סטריליות. הפעל את תוכנת הנסיין. הגדר את קצב הדגימה ל- 25 kHz והתחל באיסוף נתונים על-ידי הקשה על Start DAQ. בחלונית Data Display מופיעות עקבות גולמיים של פעילות שהוקלטה מחוץ לתא עבור כל ערוץ. נטר את הפעילות הספונטנית וזהה ובחר באופן חזותי 3 זוגות של מיקרואלקטרודות שכנות הפעילות במהלך התפרצויות של התפרצויות פעילות ספונטניות מסונכרנות ברחבי הרשת, ממיקרואלקטרודות מקור או צד מטרה. בלוח המגרה של התוכנה, הגדר את הפרמטרים עבור כל אחד מזוגות המיקרואלקטרודות המגרים בתצורה דו-קוטבית: בחר צורת גל דו-פאזית והגדר את אמפליטודות השיא ל- ± 800 mV, ואת משך הדופק ל- 200 μs. הגדר את המקליט וההקלט לתקופה של 300 אלפיות השנייה לפני עד 1000 אלפיות השנייה לאחר הגירוי. חזור על שלבים 3.3.3 עד 3.3.5 עבור המקור וצד היעד באופן משולב עבור מספר החזרות הנדרש.

Representative Results

כאן מדווח על ייצור של התקן תרבית תאים פולימרי (עצבי) בעל 2 תאים, המדגים את השימוש בהדפסת תלת-ממד 2PP לאב-טיפוס מהיר של התקני PDMS. באופן ספציפי, מכשיר מיוצר עבור רשתות נוירונים מודולריות עם קישוריות סינפטית חד כיוונית והאפיון התפקודי שלו מוצג במונחים של אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית מרובת אתרים. בקצרה, תבנית בקנה מידה מיקרומטרי מומשה באמצעות כתיבה לייזר ישירה, באמצעות מדפסת תלת מימד זמין מסחרית. בפרט, המדפסת מספקת הספק של 50 mW באמצעות פולסי לייזר עם אורך גל מרכזי של 780 ננומטר ומשך של 80 עד 100 fs. במהלך תהליך הייצור, קרן הלייזר ממוקדת דרך המטרה (25x, NA=0.8) של המדפסת אל photoresist בגוון שלילי (IP-S) כדי לסרוק את נפח ההדפסה באמצעות סורק galvo עבור צירי x ו- y, ואת שלב piezo עבור ציר z. נפח ההדפסה פוצל כראוי לבלוקים של 200 מ”מ x 200 מ”מ x 265 מ”מ כדי לממש תבנית בגודל כולל של 6500 מ”מ x 6500 מ”מ x 545 מ”מ ונפח נומינלי של 12.423 מ”ל. איור 2A מייצג סקיצה דו-ממדית של התבנית, המדגישה את מידותיה ואת גודל תכונותיה, ואילו איור 2B מציג תמונת תקריב של המכשיר המוגמר המורכב על MEA. התבניות שהוכנו כמתואר בסעיף הקודם היו עמידות וניתן היה לעשות בהן שימוש חוזר יותר מ-50 פעמים לייצור מכשירי PDMS. התבנית המודפסת שימשה ליציקת התקן PDMS, שהורכב לאחר מכן על האזור הפנימי של מערכים משולבים של מצע זכוכית של מערכי מיקרואלקטרודות (MEA), כדי לשמש להקלטות חוץ-תאיות מרובות אתרים של פעילות חשמלית עצבית וכהוכחה עקרונית. MEAs משולבים במצע מסחרי שימשו לניטור הפעילות של תרביות מודולריות בתגובה לגירויים חשמליים מקומיים מרחביים המועברים מחוץ לתא על ידי תת-קבוצה של מיקרואלקרוד הממוקמת בכל תא תרבית. כל MEA מכיל 120 מיקרואלקטרודות טיטניום חנקתי (TiN) בקוטר של 30 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר בין אלקטרודות. איור 2C-D מראה את המיקום של התקן PDMS בחלק העליון של MEA. המאפיינים הגיאומטריים של מיקרו-ערוצים בודדים של המכשיר, יחד עם טביעת הרגל הכוללת של החדר שמוצגת באיור 2C, מובילים למידור של תאי העצב בתרבית. ניתן להבחין ביניהם על פי התא אליו הם שייכים, באזור החיצוני (מקור) המכשיר, או באזור הפנימי (יעד) של המכשיר. ההנחיה האקסונלית המועדפת, המוגבלת מהמקור למטרה, מוכתבת על ידי הקצוות החדים של המיקרו-ערוצים. איור 2D מראה את המיקום של ההתקן הפולימרי באזור המזרח התיכון וצפון אפריקה ואת אזור הכיסוי היחסי של אלקטרודות הקלטה הממוקמות בתאי המקור או המטרה. שים לב שיישור מדויק של החלק הפנימי של המיקרו-ערוצים של המכשיר לשורה אחת או יותר של מיקרואלקטרודות MEA לא נדרש למקרה המבחן שלנו ולא נמשך. עדות מייצגת לגדילה אסימטרית של נוריט מסופקת באיור 3, במהלך התפתחות ex vivo, המראה נוירוריטים מתויגים פלואורסצנטית בדימות חי, 6 ימים (איור 3A) ויומיים לאחר ציפוי התאים (איור 3B-D). בעוד שתאי העצב בצד המטרה של המכשיר נתקלו במחסומי זווית חדים כמכשולים המעכבים את התקדמותם במרחב, הנוירוטים שמקורם בצד המקור גדלו ללא הפרעה וחצו את הערוצים. אסימטריה זו מעדיפה קשר אקסונלי חד-כיווני בין תאי עצב בשני התאים, המקרין ממקור למטרה, כפי שנאמר במפורש בתכנון. תוצאה זו נתמכת גם על ידי הערכה אלקטרופיזיולוגית (פונקציונלית) של תגובות חשמליות המתעוררות על ידי גירויים המועברים לחלופין בכל אחד משני התאים. לאחר 3-4 שבועות במבחנה, כאשר הרשתות העצביות הגיעו לבשלות מלאה29,30, ניתן היה לבדוק את הקישוריות התפקודית בין שני התאים על ידי מתן גירויים חשמליים קצרים וניטור התגובות העצביות שהם עוררו31. דחפים חשמליים דו-פאזיים עם משרעת של 800 mV יושמו אז לחלופין רק על המקור או רק על אוכלוסיות היעד (N חזרות = 150, N תרביות מודולריות = 6), שהועברו על ידי 3 זוגות של מיקרואלקטרודות מישוריות בתצורה דו-קוטבית, ובאופן משולב. לכן, 3 זוגות האלקטרודות יכולים להיות ממוקמים באזור המקור של MEA או בתוך אזור המטרה של MEA. התגובות החשמליות המתעוררות על ידי כל גירוי יכולות להיות מזוהות על ידי כל מיקרואלקטרודות MEA לאחר עיכוב התפשטות. ההקלטות בוצעו בקצב דגימה של 25 קילוהרץ לערוץ, והאותות החשמליים הגולמיים החוץ-תאיים שהתקבלו עברו דיגיטציה ברזולוציית המרה אנלוגית לדיגיטלית של 16 סיביות. אלגוריתם זיהוי שיאחוצה סף 32 שימש במצב לא מקוון כדי לזהות את זמן ההתרחשות של פוטנציאלי פעולה חוץ-תאיים, מבלי לבצע מיון ספייק. איור 4A-B חושף בבירור אסימטריה חזקה של תגובות מעוררות, החוזרות על עצמן 150 פעמים, בהתאם למיקום העברת הגירוי, מה שמרמז על השפעה תפקודית משמעותית של האילוצים הגיאומטריים על הכיווניות המועדפת של קישוריות. למעשה, עם גירוי צד המקור, קצב הירי של אוכלוסיית תאי העצב של המקור – המוערך על ידי חישוב ההיסטוגרמה של ספייק-גירוי-פעמים – גדל כצפוי ויצר פרץ רשת מלא של פוטנציאלי פעולה 33,31,34 ואחריו הוא, לאחר עיכוב, עלייה בקצב הירי של אוכלוסיית היעד. עם זאת, ככל שהגירוי הועבר בתוך אוכלוסיית היעד, רק קצב הירי של אוכלוסיית היעד גדל ואוכלוסיית המקור נותרה שקטה ברובה. איור 4C-D חוזר על אותה פרדיגמת גירוי/תגובה בתרבית ביקורת, ללא נוכחות מכשיר פולימרי (כלומר, תרבית עצבית לא מובנית), הגירויים החוץ-תאיים הועברו גם הם במשך 4 חזרות. עבור תנאי בקרה כאלה, לא התרחשה אסימטריה בתגובות שעוררו שני הגירויים. בעוד שתת-הקבוצה של מיקרואלקטרודות MEA המשמשות להעברת הגירויים תאמה לזו המשמשת ברשתות מודולריות, המיקום של העברת הגירוי הוביל לתגובה מעוררת דומה מכלל האוכלוסייה. זה מאשר כי התקן PDMS העדיף קישוריות סינפטית חד-כיוונית, על פני שני התאים. באופן כללי, תגובות אסימטריות המתעוררות בתרביות מודולריות (N = 6) ותגובות סימטריות המתעוררות בתרביות ביקורת (N = 4) מצביעות בבירור על קישוריות אנטומית מוגבלת של מערכת מבחנה ממודרת. הנתונים האלקטרופיזיולוגיים והסקריפטים ששימשו ליצירת איור 4 זמינים באמצעות Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990). איור 1: סקיצה של ייצור מיקרו-עובש 2PP והעתק PDMS. (A) מודל תלת-ממדי מתוכנן ב-CAD ומיוצא בקובץ בפורמט Standard Tessellation Language (STL ), (B) מורה על הדפסת תלת-ממד של 2 פוטונים באמצעות פילמור המושרה בלייזר בתוך טיפת שרף (IP-S). (C) המבנה המתקבל משמש כתבנית לייצור חוזר ונשנה של העתקי PDMS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: דוגמה לאב-טיפוס מהיר פנימי של התקן PDMS פולימרי (עצבי) בתרבית תאים. (A) תוך פחות מ-24 שעות, ייצור תוספים בקנה מידה זעיר מאפשר מעבר ממודל CAD למאסטר מודפס בתלת-ממד, לשימוש מיידי, ושוב ושוב, כתבנית העתק עם אלסטומרים תואמים ביולוגית, כגון PDMS. (ב-ג) התקני PDMS המתקבלים מצומדים למצע מישורי של תרבית תאים עצבית, המיוצג כאן על ידי מערך של מיקרואלקטרודות. עבור תכנון הדגימה הספציפי ב- (A), מוגדרים שני תאים: אחד המכונה מקור ומסומן על ידי S, והשני מכונה מטרה ומסומן על ידי T. (D) תאי עצב המצופים בכל תא יכולים לגדל את הנוירוטים שלהם רק באמצעות סדרה של מיקרו-ערוצים. כאשר הן מיושרות כראוי תחת הנחיית מיקרוסקופ סטריאו ב- (C), שתי קבוצות של מיקרואלקטרודות משולבות מצע נותרות חשופות, כך שניתן לגרות ולהקליט את הפעילות הביו-חשמלית של תאי עצב סמוכים הממוקמים בשני התאים. שימו לב כאן שיישור מיקרואלקטרודות בתוך מיקרו-ערוצים בודדים לא היה בראש סדר העדיפויות של הוכחת עיקרון זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: הדמיה חיה של מולקולות כתב פלואורסצנטיות של תאים מזהה נוירונים מוארכים על-ידי תאי עצב, כמה ימים לאחר ציפוי התא. (א-ד) מיקרוגרפים פלואורסצנטיים קונפוקליים מייצגים של תרביות עצביות מודולריות של המכשיר שיוצר מאיור 1 ומאיור 2 (N=4, 128 מיקרו-ערוצים בודדים) נרכשו יומיים ושישה ימים לאחר ציפוי התאים. (ב-ד) הגדלה של פי 40 וסולם אפור הפוך של המיקרוגרפים לנראות מוגברת. הסיומות של המיקרו-ערוצים מתאי המקור והיעד מסומנות ב-S וב-T, בהתאמה. (A) מראה את תמונת הסריקה הרחבה של התרבית, כאשר המקור (כלומר, השטח הריבועי הפנימי) והיעד (כלומר, האזור החיצוני) מלאים בתאים, 6 ימים לאחר הציפוי. (B) ו- (C) מציגים, בנקודת הזמן המוקדמת יותר של יומיים לאחר הציפוי, את צמיחת הנוירוטים במקור ובצדדי המטרה של המיקרו-תעלות, בהתאמה. המשולשים השחורים הקטנים מצביעים על דוגמאות מייצגות של צרורות אקסונים משוערים, שמקורם כנראה רק במקור. גבולות המיקרו-ערוצים בצורת החץ מצביעים על התארכות של תאי עצב לאורך הקצה (B), שם המעבר שלהם הוא ללא הפרעה ומונחה לעבר המטרה. בכיוון ההפוך, וליד קצה המטרה של מיקרו-ערוץ (C), נוירוטים שמקורם במטרה ומתקדמים לצד המקור לכודים בפינות החדות. (D) חושף עוד יותר את הפרטים של צמיחת עצבים בתוך מיקרו-ערוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: אפיון תפקודי של תגובות חשמליות עצביות, עם ובלי התקן PDMS. MEAs שימשו כמצעי תרבית תאים ושימשו למדידת תגובות הספייקינג ברחבי הרשת המתעוררות על ידי פולס גירוי חשמלי דו-פאזי קצר מאוד (כלומר, 200 μs, 0.8V), המועבר בתצורה דו-קוטבית. במכשיר PDMS באיור 2, תגובות הספייקינג העצביות שתועדו מהמקור (אדום) ומהמטרה (כחול) משתנות, כתלות במיקום שבו הגירוי מועבר. עיכובים אקסונליים, סינפטיים ועיכובי אינטגרציה מתגלים ב- (A) אך לא ב- (B), דבר המצביע על קיומה של קישוריות סינפטית מועדפת (כלומר, ממקור למטרה). (ג-ד) בתנאי בקרה (כלומר, ללא התקן PDMS), תגובות מעוררות המזוהות בשתי קבוצות נפרדות של מיקרואלקטרודות MEA אינן תלויות במיקום אספקת הגירוי. ההצללה החיוורת, העוטפת את הקווים בחלקות, מציינת את שגיאת התקן המיידית של הממוצע (N גירויים = 150). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. שם הפתרון הרכב פוליאתילנאמין (PEI) 0.1% 1 מ”ל של תמיסת מלאי PEI, 9 מ”ל של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (DI). מדיום תרבות (50 מ”ל) Minimum Essential Medium (MEM), בתוספת 20 מיקרומטר גלוקוז, 50 מיקרוגרם/מ”ל גנטמיצין, 50 מיקרומטר L-גלוטמין ו-10% סרום סוסים מומת חום. דיסקציה בינונית (1000 מ”ל) הנקס′ מלחים מאוזנים 9.52 גרם, סודיום ביקרבונט 350 מ”ג, HEPES 2.83 גרם, D-(+)-גלוקוז 6 גרם, חומצה Kynurenic (ריכוז סופי 200 μM), D-AP5 (ריכוז סופי 25 μM), Gentamicin 250 μl, אלבומין סרום בקר 300 מ”ג, מגנזיום גופרתי 1.44 גרם. יש לכוונן את רמת החומציות ל-7.3, להגן מפני אור ולאחסן בטמפרטורה של 4°C. עיכול בינוני (100 מ”ל) נתרן כלורי 800 מ”ג, אשלגן כלורי 37 מ”ג, די-נתרן מימן פוספט 99 מ”ג, HEPES 600 מ”ג, סודיום ביקרבונט 35 מ”ג, חומצה Kynurenic, 200 μL (ממלאי 100 mM), D-AP5 100 μL (ממלאי 25 mM). כוונן את ה- pH ל- 7.4, הגן מפני אור ואחסן ב- 4 ° C. פתרון 1 טריפסין 5 מ”ג, Deoxyribonuclease I 1.5 מ”ג, ב 2 מ”ל של מדיום העיכול. פתרון 2 מעכב טריפסין 5 מ”ג, ב 5 מ”ל של מדיום דיסקציה. פתרון 3 Deoxyribonuclease I 1.5 גרם, ב 2.5 מ”ל של מדיום דיסקציה. טבלה 1: טבלת פתרונות. עיין בטבלת החומרים לקבלת תיאורי מוצרים. קובץ קידוד משלים 1: קובץ התכנון STL מתאים למבנה המתואר באיור 2A. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

למרות היותו בן עשרות שנים, היישום של טכנולוגיית 2PP בדפוס העתק מבוסס PDMS בקנה מידה מיקרומטרי הוא פיתוח לאחרונה43,44. בהקשר זה, סדרה של נקודות נדונות להלן כדי לסייע למשתמשים לשחזר ביעילות עבודה זו.

עבור עיצוב מודל תלת ממדי, ודא כי המודל אינו כולל חורים או הצטלבויות עצמיות. הענק הרשאה לתבנית הקובץ הבינארית בשעת שמירה כ- STL, עבור טביעת הרגל הקטנה יותר של גודל הקובץ מאשר בקידוד ASCII. זה מועיל במיוחד עבור עיצובים עם גיאומטריות מורכבות עבור אובייקטים ברוחב מיליליטר. שימוש בקבצי STL בינאריים מרמז גם על עומס CPU נמוך, בהמשך התהליך הכנת החלק המכני להדפסה תלת-ממדית. הממדים הפיזיים של התכונות בתוך קובץ STL מיוצגים ביחידות חסרות ממד. במהלך עיבוד קובץ STL, יחידות מפורשות כמיקרומטרים. לכן, מומלץ לאמץ מראש את יחידת העניין, כלומר מיקרומטר, בעת הכנת הקובץ. הדיוק של המודל המודפס נקבע על ידי מספר המשטחים הקרובים למשולשים. עבור מספר לא מספיק של משטחים, חספוס פני השטח הרצוי יתפתח. עם זאת, שאיפה לדיוק גבוה מדי על ידי מספר גדול מאוד של משטחים באה במחיר של עומס חישובי גבוה, מה שגורם לעיבוד הקובץ להיות איטי.

עבור הדפסה תלת מימדית, במהלך ההדפסה, האובייקט הפיזי התלת-ממדי נוצר באמצעות סריקת גלבו מהירה במישור x-y ותנועת piezo בכיוון z. פעולה זו ממקדת את קרן הלייזר הפמטו-שנייה בתוך כל ווקסל תלת-ממדי נתון. עם זאת, כאשר מבני ההדפסה גדולים יותר מטווחי הכיסוי המרחבי של הגאלבו והפיזו, יש לפצל את האובייקט באופן פרוגרמטי לגושים. בעוד שזו דרישה לחלקים מודפסים בגודל מילימטרי, צמתים בין בלוקים קשורים לקווי תפירה (לא מושלמים). אופטימיזציה זהירה של ספירת בלוקים ומיקום קווי תפירה בכיווני x, y ו- z חיוניים כדי למנוע הפרעה לתכונות גיאומטריות קריטיות של האובייקט הסופי עם קווי תפירה. בועות עלולות להיווצר בממשק ההדפסה מסיבות שונות (למשל, מצע הזיהומים וחוסר ההומוגניות של photoresist), ולהשפיע לרעה על איכות ושלמות המבנה המודפס. יתר על כן, כוח לייזר גבוה יותר יכול להוביל לעלייה בהתרחשותם. הפחתת עוצמת הלייזר, בשכבה הנמוכה ביותר של החלק המודפס, תמזער את הסיכויים להיווצרות בועות. כחלופה להדפסת החלק כולו כמבנה מוצק, ניתן לשקול שיטת מעטפת ופיגום. זה כרוך להדפיס רק את פני השטח החיצוניים של החלק (פגז), כמו גם אלמנטים מנסרה משולש בתוכו. אלמנטים אלה מופרדים על ידי שכבות אופקיות (פיגומים), המחזיקים את השרף הלא פולימרי בכיסים קטנים. שיטה זו מקצרת משמעותית את זמן ההדפסה, רלוונטי במיוחד עבור מבנים בגודל מילימטרי. עם זאת, מכיוון שנשאר שרף לא פולימרי, חשיפה לקרינת UV לאחר ההדפסה הכרחית כדי להבטיח יציבות מכנית מלאה, אם כי שלב זה חייב להתבצע בעדינות כדי למנוע עיוות של החלק המודפס. הזמן שלאחר הריפוי תלוי בשרף הנבחר, בעובי החלק ובעוצמת UV40. לקבלת תוצאות מיטביות, מומלץ לבצע ניסוי ראשוני כדי להעריך את הזמן הדרוש לריפוי מעמיק מלא, באמצעות טיפת photoresist והערכת חתך חתך שלה, לאחר חשיפה UV. תקופת הריפוי הרגילה נעה בין 5 ל -20 דקות.

עבור תבניות העתק PDMS, ייצור נקי של התקן PDMS עם תכונות בקנה מידה מיקרומטרי, ללא מתקני חדר נקי, יכול להיות מאתגר: מיקרו-חלקיקים הנישאים באוויר יכולים לשכון על פני השטח הדביקים מאוד של PDMS ולעכב את האטימה בין המכשיר למצע, או לחסום את החלק של מיקרו-ערוצים בודדים. ביצוע שלבי הפרוטוקול מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית ומיגון עקבי של משטח PDMS עם איזופרופנול ממזער באופן משמעותי את סיכוני הזיהום. טמפרטורת הריפוי ומשכה משפיעים ישירות על קישור צולב PDMS ועל התכונות הפיזיקליות הנובעות מכך. בפרט, הדבקה של PDMS נרפא הוא גורם קריטי. מצד אחד, נדרש אטימה הדוקה בין מכשיר PDMS, לבין המשטח המשמש לתרבית תאים עצביים (למשל, כיסוי זכוכית או MEA), כדי להגביל ביעילות את המעבר של הנוירוטים. מצד שני, מכשיר ה-PDMS צריך להיצמד למשטח באופן הפיך, כך ששכבת הבידוד העדינה לא תיפגע לאחר הסרת המכשיר. בעוד התכווצות PDMS במהלך הריפוי מתרחשת וניתן לתקן אותה על ידי שינוי קנה מידה מראש של התבנית, עבור טמפרטורות ומרווחי ריפוי המצוינים כאן התכווצות תהיה קטנה מ -2% 42 ולא תשפיע באופן משמעותי, מכשירי PDMS חד שכבתיים. בסך הכל, עקוב במדויק אחר ערכי טמפרטורת הריפוי ומשך הזמן המומלצים, לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

סקירה כללית של יתרונות ומגבלות השיטה
טכניקה המבוססת על כתיבת לייזר ישירה של 2 פוטונים מוצעת לייצור מהיר של התקנים פולימריים בקנה מידה מיקרו למחקר ניסיוני של רשתות עצביות מודולריות. בניגוד לפוטוליתוגרפיה רכה, הגישה המוצעת אינה דורשת רמה גבוהה של מומחיות טכנית, בתנאי שמערך הדפסה תלת-ממדית 2PP פונקציונלי נגיש ותפעולי. למרבה הפלא, השיטה מאפשרת מעבר ממודל תלת ממדי שתוכנן על ידי CAD למכשיר PDMS פונקציונלי תוך יום אחד, ובכך מספקת נתיב ישיר ויעיל מרעיון למימוש מוחשי. באופן ספציפי, בחירה במצב הדפסת פגז ופיגומים מפחיתה באופן משמעותי את הזמן הדרוש ליצירת התבנית, מכיוון שרק חלק קטן מהנפח שלה מודפס. ריפוי UV לאחר מכן של הרכיב המודפס מבטיח את יציבותו המכנית ואת חוסנו, כפי שאומת כאן מעל 50 מחזורי יציקה עם PDMS.

בהשוואה לשיטות מסורתיות, הדפסת תלת מימד 2PP מתגאה ביתרון ברור, הבולט ביותר כשמדובר בייצור תבניות עם יחס גובה-רוחב משמעותי, דרישות רזולוציה תובעניות וגיאומטריות תלת מימדיות מורכבות. הייצור של תבניות אב באמצעות ליתוגרפיית UV סטנדרטית מוגבל על ידי עובי התנגדות של כ 200 מיקרומטר. רצפים מורכבים של מחזורי ציפוי וחשיפה35, LIGA (ליתוגרפיה, ציפוי אלקטרוליטי ויציקה) יקרים או תהליכי תחריט יונים תגובתי עמוק (DRIE)36 נדרשים כדי להשיג יחסי גובה וגובה-רוחב גדולים יותר. בניגוד חד, כפי שהודגם בעבודה החלוצית של קומי ואחרים בשנת 201037, טכניקת 2PP מציעה טווח בלתי מוגבל למעשה ליחס הממדים של החלקים המודפסים, המשתרע מתת-מיקרומטר ועד מילימטרים. כאן הודגם תהליך מיקרו-ייצור של תבנית עם הפרש משמעותי בגובה חלקיה, הכולל הבחנה של יותר מפי 100 בין גובה המיקרו-ערוצים (5 מיקרומטר לגובה המרבי של העובש (545 מיקרומטר; ראה איור 2).

כמו כן, ניתן להשיג בקלות רזולוציה תת-מיקרומטרית על ידי ביצוע מפרטי הפרוטוקול המתוארים. לשם השוואה, השגת רזולוציות עובש משופרות באמצעות פוטוליתוגרפיה UV דורשת השקעת הון. המסכות בעלות הרזולוציה הטובה ביותר, המשתמשות בתצהיר כרום על קוורץ ברזולוציה נומינלית של 600 ננומטר, מתומחרות בכמה סדרי גודל גבוה יותר ממסכות השקיפות העילית המודפסות בלייזר, בעלות רזולוציה של 250 מיקרומטר35, אולם ראו את עבודתם של Pirlo et al.41. כדי להיות בת קיימא לשימוש פנימי, השיטה שנבחרה חייבת להיות חסכונית. עבור מעבדות ביולוגיות רבות, ההוצאה הכוללת הקשורה לפוטוליתוגרפיה רכה קונבנציונלית או כתיבה ישירה בלייזר מהווה מכשול. אמנם ניתן להפוך את שתי הטכנולוגיות לנגישות יותר על ידי רכישה והרכבה של הרכיבים החיוניים, אך גישה זו דורשת מומחיות נוספת ועדיין דורשת השקעה ניכרת. בהקשר זה, נקודה חיונית שיש לקחת בחשבון היא הספקטרום הרחב יותר של יישומים הניתנים להשגה באמצעות כתיבה ישירה בלייזר. שלא כמו פוטוליתוגרפיה רכה קונבנציונלית, המוגבלת בעיקר לייצור מיקרו-עובש, הדפסת תלת-ממד 2PP מפגינה רב-תכליתיות יוצאת דופן. היישומים הפוטנציאליים שלה משתרעים ממיקרופלואידיקה ומיקרו-אופטיקה ועד פוטוניקה ומיקרומכניקה משולבות. זה הופך את ההשקעה בטכנולוגיה זו למושכת כמתקן משותף לתחומים מדעיים מרובים ומגוונים. לדוגמה, המתודולוגיה מבוססת 2PP שפותחה בפרוטוקול זה היא תוצאה של שיתוף פעולה בין-תחומי בין מחלקות מדעי המוח והמתמטיקה בתוך המוסד שלנו. בנוסף, פיתוח photoresist הוא תחום מחקר פעיל, והוא עשוי להרחיב את מגוון היישומים של הדפסה תלת-ממדית 2PP. מקרה לדוגמה הוא ההקדמה האחרונה של שרף IP-PDMS. על ידי פילמור למבנים בעלי תכונות כמו PDMS38, שרף זה פותח את הפוטנציאל למיקרו-ייצור ישיר של רכיבים בעלי תאימות ביולוגית בעלי משטח מפותל או מכילים חללים חלולים. מורכבויות אלה עומדות כמחסומים להשגת תוצאות דומות באמצעות הליכי דפוס העתק קונבנציונליים.

כהדגמה של שיטה זו, הובאו ראיות המצביעות על התפתחות קישוריות חד-כיוונית בין שני מודולים ברשת עצבית מודולרית. התבנית בקנה מידה מיקרו, המיוצרת בטכניקת 2PP, הייתה בעלת סיבולת מספקת כדי לעבור יציקות PDMS מרובות, ויש לה את הדיוק הנדרש בקנה מידה מיקרו. לסיכום, היקף היישום של הפרוטוקול המתואר בעבודה זו משתרע מעבר למקרה המתואר. ככל שהגישה לטכנולוגיית ההדפסה 2PP הופכת נפוצה יותר ויותר, ההשקעה הראשונית הנדרשת ליישומה תקטן בעוד מגוון היישומים הפוטנציאליים שלה יתרחב.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מ.ג. מכירה בתמיכה כספית מתוכנית המסגרת H2020 של האיחוד האירופי באמצעות מועצת החדשנות האירופית (פרויקט IN-FET, GA n. 862882, פרויקט Arbor-IO, FLAG-ERA ופרויקט המוח האנושי, ID 650003) ומ- SISSA (אזור מדעי המוח). G.N. מודה בתמיכה כספית ממשרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (MUR) באמצעות המענק Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (אזור מתמטיקה). אנו מודים ל- M. Gigante, B. Pastore ו- M. Grandolfo על עזרתם בהדפסה תלת-ממדית, תרבית תאים והדמיה חיה, כמו גם לד”ר P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente ו- H.C. Schultheiss על הדיונים. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתב היד.

Materials

2-Propanol Sigma-Aldrich 650447
BB cure compact polymerizer PCube Srl Wavelengths 365-405 nm, Power 120W
BioMed Amber Resin 1 L formlabs Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
CAD application software SolidWorks Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US).
                                 ————————————–
Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html
Trainings: https://www.autodesk.com/training
CellTracker Green CMFDA Invitrogen C7025
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
D-AP5 Tocris #0106
Deoxyribonuclease I Sigma-Aldrich D5025
DeScribe Nanoscribe GmbH & Co. KG
di-Sodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 106585
Gentamicin Thermo Fisher 15710049
Hanks′ Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387
HEPES Sigma-Aldrich H7523
Horse Serum Sigma-Aldrich H1138
in vitro MEA recording system MEA2000 mini Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany
IP-S Photoresist Nanoscribe GmbH & Co. KG
Kynurenic acid Sigma-Aldrich K3375
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030081
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643
MEA recording application software (Experimenter) Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany
Minimum Essential Medium Sigma-Aldrich 51412C
NanoWrite Nanoscribe GmbH & Co. KG
ophthalmic stab Knife 15° HESTIA Medical
Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer Nanoscribe GmbH & Co. KG SN617
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA
Poly(ethyleneimine) solution Sigma-Aldrich P3143
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911
Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) Sigma-Aldrich 484431
Repel-silane ES Sigma-Aldrich GE17133201
Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL Nanoscribe GmbH & Co. KG
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm
SYLGARD 184 Kit Dow Corning
Trypsin Sigma-Aldrich T1005
Trypsin inhibitor Sigma-Aldrich T9003
vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles  CIMAMOTORI

References

  1. Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13 (2011).
  2. Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
  3. Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Designing neural networks in culture. Proc IEEE Inst Electr Electron Eng. 98 (3), 398-406 (2010).
  4. DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32 (2016).
  5. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010 (2012).
  6. Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044 (2020).
  7. Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400 (2014).
  8. Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157 (2016).
  9. Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
  10. Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424 (2016).
  11. Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
  12. Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031 (2011).
  13. Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington’s disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
  14. Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  15. Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
  16. Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
  17. Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
  18. Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625 (2017).
  19. le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412 (2015).
  20. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  21. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie – International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
  22. Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
  23. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276 (2017).
  24. Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307 (2019).
  25. Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
  26. Baldacchini, T. . Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , (2015).
  27. Madou, M. J. . Fundamentals of Microfabrication. , (2018).
  28. Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
  29. Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
  30. Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
  31. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056 (2010).
  32. Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26 (2014).
  33. Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701 (2016).
  34. Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49 (2017).
  35. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
  36. Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
  37. Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
  38. Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
  39. Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  40. Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
  41. Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408 (2011).
  42. Madsen, M. H., Feidenhans’l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002 (2014).
  43. Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
  44. Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).

Play Video

Cite This Article
Hosseini, A., Noselli, G., Giugliano, M. Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices. J. Vis. Exp. (208), e66142, doi:10.3791/66142 (2024).

View Video