Summary
이 프로토콜은 기존의 액체 배양 또는 페트리 접시보다 자연 서식지에 더 가까운 복잡한 3D 다공성 하이드로겔 매트릭스에서 박테리아 군집의 운동성과 성장을 연구하기 위한 박테리아 군집의 3차원(3D) 프린팅 절차를 설명합니다.
Abstract
박테리아는 생물학적 조직 및 겔과 같은 복잡한 3차원(3D) 다공성 환경, 지하 토양 및 퇴적물에서 어디에나 있습니다. 그러나 이전 연구의 대부분은 벌크 액체 또는 평평한 표면의 세포 연구에 중점을 두었으며, 이는 많은 자연 박테리아 서식지의 복잡성을 완전히 요약하지 못했습니다. 여기에서 이러한 지식의 격차는 박테리아의 조밀한 군집을 걸린 과립형 하이드로겔 매트릭스에 3D 프린팅하는 방법의 개발을 설명함으로써 해결됩니다. 이 매트릭스는 조정 가능한 공극 크기와 기계적 특성을 가지고 있습니다. 그들은 세포를 물리적으로 가두어 3D로 지지합니다. 광학적으로 투명하여 이미징을 사용하여 주변을 통해 퍼지는 박테리아를 직접 시각화할 수 있습니다. 이 원리의 증거로, 이 프로토콜의 기능은 다양한 간질 기공 크기를 가진 걸린 과립형 하이드로겔 매트릭스에서 비운동성 및 운동성 Vibro cholerae와 비운동성 Escherichia coli 를 3D 프린팅 및 이미징하여 입증되었습니다.
Introduction
박테리아는 종종 장과 폐의 점막 젤에서 땅의 토양에 이르기까지 다양하고 복잡한 3D 다공성 환경에 서식합니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25입니다. 이러한 환경에서, 운동성 또는 성장을 통한 박테리아의 이동은 고분자 네트워크 또는 고체 미네랄 알갱이의 패킹과 같은 주변 장애물에 의해 방해받을 수 있으며, 이는 세포가 환경을 통해 확산되는 능력에 영향을 미칠 수 있습니다26, 영양 공급원에 접근하고, 새로운 지형을 식민지화하고, 보호 생물막 군집을 형성하는 능력27. 그러나 전통적인 실험실 연구는 일반적으로 액체 배양 또는 평평한 표면의 세포에 초점을 맞춘 매우 단순화된 형상을 사용합니다. 이러한 접근 방식은 미생물학에 대한 중요한 통찰력을 제공하지만, 자연 서식지의 복잡성을 완전히 요약하지 못하기 때문에 실제 환경에서 수행된 측정과 비교하여 성장률과 운동성 거동에 극적인 차이가 발생합니다. 따라서 박테리아 군집을 정의하고 많은 자연 서식지와 더 유사한 3D 다공성 환경에서 박테리아 군집의 운동성과 성장을 연구하는 방법이 매우 필요합니다.
세포를 한천 겔에 접종한 다음 눈으로 또는 카메라를 사용하여 거시적으로 퍼지는 것을 시각화하는 것은 1936년 Tittsler와 Sandholzer가 처음 제안한 바와 같이 이를 달성하는 한 가지 간단한 방법을 제공합니다28. 그러나, 이 접근법은 여러 가지 중요한 기술적 도전에 시달리고 있다: (1) 공극 크기는, 원칙적으로, 아가로스 농도를 변화시킴으로써 변화될 수 있지만, 그러한 겔의 공극 구조는 불분명하다; (2) 광 산란은 이러한 겔을 탁하게 만들어 특히 큰 샘플에서 높은 해상도와 충실도로 개별 규모의 세포를 시각화하기 어렵게 만듭니다. (3) 한천 농도가 너무 크면 세포 이동이 겔의 상단 평평한 표면으로 제한됩니다. (4) 이러한 겔의 복잡한 유변학은 잘 정의된 형상을 가진 접종물을 도입하는 것을 어렵게 만듭니다.
이러한 한계를 해결하기 위해 이전 연구에서 Datta의 실험실은 액체 박테리아 배양액으로 부풀어 오른 걸린 생체 적합성 하이드로겔 입자로 구성된 과립형 하이드로겔 매트릭스를 "다공성 페트리 접시"로 사용하여 세포를 3D로 제한하는 대체 접근 방식을 개발했습니다. 이러한 매트릭스는 부드러움, 자가 치유, 항복 응력 고체입니다. 따라서, 다른 바이오프린팅 공정에서 사용되는 가교 겔과 달리, 주입 마이크로노즐은 하이드로겔 입자(29)를 국부적으로 재배열함으로써 임의의 규정된 3D 경로를 따라 매트릭스 내부에서 자유롭게 이동할 수 있다. 그런 다음 이러한 입자는 빠르게 재조밀화되고 주입된 박테리아 주변에서 자가 치유되어 추가적인 유해한 처리 없이 세포를 제자리에 지지합니다. 따라서 이 공정은 박테리아 세포를 조정 가능한 물리화학적 특성을 가진 다공성 매트릭스 내에서 정의된 군집 구성으로 원하는 3D 구조로 배열할 수 있도록 하는 3D 프린팅의 한 형태입니다. 또한 하이드로겔 매트릭스는 완전히 투명하여 이미징을 사용하여 세포를 직접 시각화할 수 있습니다.
이 방법의 유용성은 이전에 두 가지 방법으로 입증되었습니다. 한 세트의 연구에서, 희석된 세포는 하이드로겔 매트릭스 전체에 분산되어 개별 박테리아30,31의 운동성을 연구할 수 있었다. 또 다른 연구 세트에서는 다세포 군집이 프로그래밍 가능한 현미경 스테이지에 장착된 주입 노즐을 사용하여 센티미터 크기의 겔로 3D 프린팅되어 주변 환경을 통한 박테리아 집단의 확산에 대한 연구를 가능하게 했습니다32,33. 두 경우 모두, 이러한 연구는 액체 배양/평평한 표면에 서식하는 박테리아와 비교하여 다공성 환경에 서식하는 박테리아의 확산 특성에서 이전에 알려지지 않은 차이점을 보여주었습니다. 그러나 현미경 스테이지에 장착되었다는 점을 감안할 때 이러한 이전 연구는 작은 샘플 부피(~1mL)로 제한되어 실험 시간이 짧았습니다. 그들은 또한 높은 공간 분해능으로 접종 기하학을 정의하는 능력에 한계가 있었습니다.
여기에서는 두 가지 한계를 모두 해결하는 이 실험적 플랫폼의 차세대 기술에 대해 설명합니다. 특히, 주사기 압출기가 부착된 수정된 3D 프린터를 사용하여 박테리아 콜로니를 대규모로 3D 인쇄 및 이미지화할 수 있는 프로토콜이 제공됩니다. 또한, 대표 데이터는 이 접근법이 박테리아의 운동성과 성장을 연구하는 데 어떻게 유용할 수 있는지를 보여주며, 생물막-전 비브리오 콜레라와 플랑크톤 대장균 을 예로 사용합니다. 이 접근 방식을 통해 박테리아 군집을 장기간에 걸쳐 유지하고 다양한 이미징 기술을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 따라서 3D 다공성 서식지에서 박테리아 군집을 연구하는 이 접근 방식의 능력은 장, 피부, 폐 및 토양의 미생물 치료 및 연구에 영향을 미치는 엄청난 연구와 응용 잠재력을 가지고 있습니다. 더욱이, 이 접근법은 미래에 박테리아 기반의 공학적 살아있는 재료를 더 복잡한 독립형 모양으로 3D 프린팅하는 데 사용될 수 있습니다.
Protocol
이 접근법은 Tashman et al.34에 의해 이전에 확립된 프로토콜을 사용하여 상업용 3D 융합 증착 모델링 프린터를 3D 바이오프린터로 변환하는 것입니다. 간단히 말해서 Tashman et al.은 상업용 압출기 헤드를 맞춤형 주사기 펌프 압출기로 교체했습니다. 이 압출기는 박테리아 세포의 고농축 액체 현탁액을 3D로 인쇄할 수 있으며, 압출된 부피와 3D 위치는 G 코드 프로그래밍 언어로 제어됩니다. 압출 체적은 압출기 단계(E-step)에 의해 소프트웨어에서 지정되며 아래에 설명된 대로 추가로 보정됩니다. 따라서 이러한 박테리아 현탁액은 세포에 대한 3D 지지체 역할을 하는 과립형 하이드로겔 매트릭스에 직접 인쇄됩니다. 아래 프로토콜은 다양한 폴리머 농도의 매트릭스를 준비하고, 공극 크기 및 유변학적 특성의 결과 변화를 특성화하고, 직접 이미징을 사용하여 후속 박테리아 운동성 및 성장을 특성화하는 방법도 설명합니다.
1. 상업용 3D 프린터를 3D 바이오프린터로 전환
- 상업용 3D 프린터에서 압출기와 히터를 제거합니다( 재료 표 참조).
- 이전 프로토콜에 따라 주사기 펌프 압출기(34)를 제작하고, 일회용 루어 잠금 주사기를 수용하기 위한 추가 수정을 가한다. 주사기 펌프 압출기를 프린터에 장착합니다.
참고: 플라스틱 주사기용 주사기 펌프 압출기를 수정하는 데 필요한 CAD 파일은 보충 파일 1-3에 나와 있습니다. - 컴퓨터에 3D 프린터 소프트웨어( 재료 표 참조)를 설치하고 엽니다. 3D 프린터를 컴퓨터에 연결합니다.
- 메커니즘의 위쪽 절반과 아래쪽 절반을 정렬하여 적절한 크기의 바늘이 있는 1mL 일회용 주사기를 3D 프린팅 클램프에 로드합니다(그림 1). cl 고정amp3개의 M8 소켓 볼트와 얇은 강철 육각 너트를 사용하여 주사기 주위에 s를 사용합니다( 재료 표 참조). 주사기 플런저는 주사기 펌프 압출기의 리드 스크류와 연결됩니다. 리드 스크류를 돌려 플런저를 수동으로 들어 올려 주사기에 0.5mL의 에어 갭을 만듭니다.
- 실험에 오염이 우려되는 경우 주사기 클램프 복합체를 바이오 후드로 운반하고 다음 단계를 완료하기 전에 입구 시 70% 에탄올 스프레이로 멸균하십시오.
2. 세균성 현탁액의 제조
- V. cholerae 및 E. coli의 경우 37°C의 2% Lennox LB(Luria Broth, 재료 표 참조) 한천 플레이트에서 밤새 성장합니다.
- V. cholerae의 경우 10개의 멸균 유리 구슬을 사용하여 3mL의 액체 LB에 세포를 접종합니다. 37°C의 진탕 인큐베이터에서 중간 지수 단계가 ~0.9의 광학 밀도(OD) 600이 될 때까지 5-6시간 동안 세포를 성장시킵니다.
- 대장균의 경우 세포를 3mL의 액체 LB에 접종합니다. 37°C의 진탕 인큐베이터에서 밤새 세포를 성장시킵니다. OD가 0.6에 도달할 때까지 신선한 LB에 200μL의 하룻밤 배양을 3시간 동안 접종합니다.
- 배양액을 10mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 배양액을 실온에서 5,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 상층액을 제거합니다. ~10μL의 액체 LB로 재현탁하여 mL당 ~9 x 1010 세포의 세포 밀도를 달성합니다.
3. 박테리아 현탁액을 주사기에 넣기
알림: 박테리아를 주사기에 로드하는 두 가지 방법이 제공됩니다(3.1단계 및 3.2단계). 3.1단계는 소량의 박테리아 현탁액(<200μL)을 로딩하는 데 사용되며, 3.2단계는 더 많은 양의 박테리아 현탁액(>200μL)을 로딩하는 데 사용됩니다. 3.1단계는 여기에 표시된 대표적인 결과를 위해 활용되었습니다.
- 빈 1mL 플라스틱 루어 락 주사기를 3D 바이오프린터에 로드합니다. 주사기 플런저를 리드 스크류로 연결합니다. 주사기를 수동으로 집어넣어 0.2mL의 에어 갭을 추가하여 각 실험 배치에 소량의 세포 ~20-50μL가 사용되므로 플런저가 주사기 내에서 이동할 수 있는 공간을 제공합니다.
- 필요한 인쇄 기능 크기에 필요한 바늘 크기로 뭉툭한 바늘을 주사기 팁에 부착합니다. 여기서는 2인치 20G 바늘이 사용됩니다.
- 바늘 아래에 박테리아 접종물이 있는 10mL 원심분리기 튜브를 놓아 박테리아 현탁액을 주사기에 넣습니다. 수동으로 나사를 돌려 주사기 플런저를 집어넣고 세포를 주사기에 넣습니다. 박테리아 세포의 부피가 너무 작아서 종종 세포가 바늘에만 로드됩니다.
- 주사기 클램프 복합체에서 플런저를 제거하고 다른 주사기와 바늘을 사용하여 주사기 클램프 복합체에 원하는 박테리아 현탁액을 조심스럽게 로드하고 기포가 갇히지 않도록 주의합니다. 주사기 클램프 복합체는 원하는 박테리아 현탁액으로 가장자리 위에 약간 채워진 다음 바이오프린터로 옮겨야 합니다.
- 플런저가 없는 주사기 클램프 복합체를 바이오 프린터 압출기의 메인 코어에 있는 해당 소켓에 조심스럽게 삽입합니다.
- 프린터 캐리지가 리드 스크류의 절반 정도에 있고 주입 접시가 로드된 주사기 아래에 있는지 확인합니다. 그런 다음 캐리지와 실린지 클램프 복합체를 통해 플런저를 캐리지에 걸릴 때까지 조심스럽게 삽입합니다. 주사기에 기포가 끼지 않도록 플런저를 박테리아 현탁액에 천천히 밀어 넣습니다.
- 어댑터 cl을 밀어amp 플런저 뒤쪽의 캐리지에 밀어 넣어 압출 및 수축 기동 모두에 대해 제자리에 고정합니다.
4. 증착된 부피에 대한 압출기 단계의 교정
- 압출기 단계(E-step)를 증착된 부피로 보정하려면 먼저 실험에 사용할 정확한 주사기, 주사기 바늘 및 증착 박테리아 현탁액을 사용하여 바이오 프린터를 설정합니다. 여기서, 1 mL 루어 락 시린지가 사용된다.
- 임의의 E-스텝 번호(~200)를 압출하여 교정할 예상 E-스텝 범위를 결정하고 주사기 부피 마커로 플런저 부피 변화를 확인합니다.
- 이 거친 E-step 대 부피 비율을 사용하여 보정 스윕 오버를 수행하기 위한 E-step 설정을 결정합니다. 예를 들어, 200의 E-스텝이 육안 검사로 약 20 μL를 압출하고 10-200 μL를 증착하려는 경우 100-2000 사이의 E-스텝을 테스트합니다.
- 선형 교정 스윕을 수행하려면 먼저 0.1mg 감도의 분석 저울에서 1.5mL 샘플링 튜브 20개의 건조 질량에 라벨을 붙이고 측정합니다.
- 박테리아 현탁액을 사전 측정된 1.5mL 튜브로 압출합니다. 각 E-스텝에 대해 최소 2회 반복실험을 수행합니다. 선형 범위의 모든 E-스텝에 대해 반복하고 필요에 따라 박테리아 현탁액을 교체합니다. 실험에 오염이 우려되는 경우 각 샘플 후에 70% 에탄올로 포화된 보푸라기가 없는 물티슈로 주사기 바늘 외부를 닦습니다.
- 동일한 분석 저울로 모든 1.5mL 튜브의 질량을 측정합니다. 두 번째 질량 값에서 첫 번째 질량 값을 빼면 증착된 박테리아 현탁액의 순 질량을 얻을 수 있습니다.
- 박테리아 현탁액의 질량을 재료 밀도가 있는 부피로 변환합니다. 주로 물로 구성된 많은 박테리아 현탁액의 경우 1g/mL가 적절한 밀도 근사치입니다.
- E-step과 압출 볼륨 사이에 선형 맞춤을 수행하여 캘리브레이션 프로세스를 완료합니다.
5. 과립형 하이드로겔 매트릭스의 제조
- 생물 안전 캐비닛에서 가교 결합 아크릴산/알킬 아크릴레이트 공중합체( 재료 표 참조)의 건조 과립을 2% Lennox Luria-Bertani(LB) 400mL에 추가하여 매트릭스를 멸균 상태로 유지합니다. 그러나, 다른 액체 세포 배양 배지를 또한 하이드로겔 매트릭스를 팽윤시키는 데 사용할 수 있다.
알림: LB에 추가되는 과립의 중량 백분율은 목표로 하는 기공 크기에 따라 다릅니다. 본 연구에서는 0.9% 입상 하이드로겔 매트릭스의 경우 LB에 3.6g의 건조 과립을 첨가하고 1.2% 입상 하이드로겔 매트릭스의 경우 LB에 4.8g의 건조 과립을 첨가합니다. 하이드로겔 과립은 스탠드 믹서에서 2분 동안 혼합하여 균질하게 분산됩니다. - 혼합이 완료되면 세포 생존율을 보장하기 위해 10M 수산화나트륨(NaOH)을 20-500μL 단위로 추가하여 pH를 7.4로 조정합니다. NaOH를 첨가할 때마다 피펫 팁을 혼합물에 담근 다음 하이드로겔 매트릭스를 pH 테스트 종이에 닦아 pH를 측정합니다.
알림: NaOH가 첨가되면 하이드로겔 과립이 팽창하기 시작하면서 혼합물의 점도가 증가합니다. 부풀어 오른 하이드로겔 과립은 직경이 ~5μm에서 10μm이고 하이드로겔 매트릭스에 함께 끼워져 있습니다. 과립의 내부 메쉬 크기는 이전에 확립된 바와 같이 ~40nm에서 100nm입니다(32). 메쉬 크기는 작은 분자(예: 산소 및 영양분)가 자유롭게 확산될 수 있을 만큼 충분히 크지만 박테리아가 간질 구멍 사이에 갇힐 수 있을 만큼 충분히 작습니다. - 다음으로, 50mL 멸균 플라스틱 주사기를 사용하여 과립형 하이드로겔 매트릭스를 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 하이드로겔 매트릭스를 실온에서 161 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 혼합 과정에서 형성된 기포를 제거합니다.
- 하이드로겔 매트릭스를 실온에서 최소 2일 동안 그대로 두어 오염이 발생하지 않도록 합니다. 오염은 하이드로겔 매트릭스에 부유하는 미세 콜로니로 나타납니다. 이틀 후 하이드로겔 매트릭스를 161 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 형성된 추가 기포를 제거합니다.
참고: 하이드로겔 매트릭스를 실온에서 최대 일주일 동안 보관하여 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - 생물 안전 작업대에서 30mL 멸균 플라스틱 주사기를 사용하여 원하는 양의 하이드로겔 매트릭스를 인쇄가 수행될 용기로 옮깁니다(여기서는 20mL 조직 배양 플라스크의 경우 ~20mL 또는 1mL 플라스틱 마이크로 큐벳의 경우 1mL가 사용됨).
6. 입상 하이드로겔 매트릭스 유변학적 특성의 특성 분석
- 하이드로겔 매트릭스 ~3mL를 거친 50mm 직경의 평행 플레이트 사이에 1mm 간격을 두고 전단 레오미터( 재료 표 참조)에 로드하여 유변학적 특성을 측정합니다.
- 전단 속도의 로그 스윕 함수로 전단 응력을 측정하여 전단 레오미터에서 단방향 전단 측정을 사용하여 항복 거동을 정량화합니다(예: 그림 2A).
참고: 낮은 전단 속도에서 하이드로겔 매트릭스는 전단 속도와 무관한 일정한 전단 응력(항복 응력)을 갖습니다. 높은 전단 속도에서 전단 응력은 전단 속도에 대한 멱법칙 의존성에 따라 증가하여 하이드로겔 매트릭스의 유동화를 나타냅니다. 이러한 항복-응력 거동을 통해 박테리아는 입상 하이드로겔 매트릭스(29) 내에서 3D 프린팅될 수 있습니다. - 변형률 진폭이 1%이고 주파수가 0.1-1Hz인 작은 진폭 진동 유변학을 사용하여 주파수의 함수로 저장 및 손실 계수 G' 및 G''를 각각 측정합니다(예: 그림 2B).
참고: 3D 프린팅을 위한 이상적인 입상 하이드로겔 매트릭스는 손실 계수보다 큰 저장 탄성률을 가져야 하며, 이는 매체가 걸린 탄성 고체(29)로 작용함을 나타낸다.
7. 과립형 하이드로겔 매트릭스 간질 기공 크기의 특성 분석
- 100nm 카르복실화 형광 폴리스티렌 나노 입자 (~ 3.6 x 1013 입자 / mL, 재료 표 참조)를 포장에 15 분 동안 초음파 처리하여 입자의 응집 / 클러스터를 분해하기 위해 재현탁시킵니다. 50μL의 나노입자를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 펠릿이 형성되고 상층액이 투명해질 때까지 실온에서 9,500 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 과립형 하이드로겔 매트릭스를 제조하는 데 사용되는 액체 성장 배지(여기서는 LB) 1mL에 펠릿을 재현탁시킵니다.
참고: 재현탁된 나노입자를 4°C에서 최대 3개월 동안 보관하여 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
- 펠릿이 형성되고 상층액이 투명해질 때까지 실온에서 9,500 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 과립형 하이드로겔 매트릭스를 제조하는 데 사용되는 액체 성장 배지(여기서는 LB) 1mL에 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 재현탁된 나노입자를 30분 동안 초음파 처리합니다. 1mL의 과립형 하이드로겔 매트릭스를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 재현탁 나노입자 1μL를 과립형 하이드로겔 매트릭스에 추가하고 피펫 팁과 혼합합니다. 혼합 후 실온에서 161 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다.
- 하이드로겔 매트릭스와 나노 입자 혼합물을 0.1mm 두께의 유리 바닥 웰이 있는 35mm 직경의 페트리 접시로 옮깁니다. 우물은 직경 20mm, 깊이 1mm입니다. 유리 커버슬립을 위에 놓고 아래로 눌러 이미징 중 흐름과 증발을 비활성화합니다. 유리 커버슬립의 대안은 상단에 파라핀 오일 1mL를 추가하는 것입니다.
- 이미징 소프트웨어에서 8배 추가 확대와 함께 40x 오일 대물렌즈가 있는 컨포칼 현미경을 사용하여 나노 입자를 이미지화합니다( 재료 표 참조).
알림: 소프트웨어에서 추가 디지털 줌을 사용하는 대신 더 높은 배율의 대물렌즈를 사용할 수 있습니다.- 시야 내에 최소 4개의 나노 입자가 있는 단일 z 평면에서 2분 동안 지연 없이(이상적으로는 ~19프레임/초) 타임 루프를 이미지화합니다. 통계에 필요한 충분한 데이터(100 내지 200 나노입자)를 수집하기 위해 서로 다른 위치에서 15 내지 20회 반복한다.
- 입자 추적 소프트웨어를 사용하여 입자의 변위를 분석합니다. 여기서, 나노 입자(35 )의 질량 중심을 추적하기 위해 고전적인 Crocker-Grier 알고리즘에 기초하여 맞춤형으로 작성된 스크립트가 사용된다( 보충 파일 7 참조).
- 입자 추적에서 평균 제곱 변위(MSD)를 계산합니다. MSD는 짧은 길이 및 시간 척도에서 공극 공간에서 자유 확산을 나타내고, 구속(35)으로 인해 큰 길이 및 시간 척도에서 아확산 스케일로 천이할 것이다.
- 국소 공극 크기를 추정하기 위해 아확산 스케일로의 전환이 발생하는 길이 스케일을 식별합니다. 이 길이 눈금을 나노 입자 직경에 추가하여 공극 크기를 계산합니다. 측정된 모든 나노 입자에 대해 공극 크기 분석을 반복합니다. 이렇게 하면 평균 기공 크기를 계산할 수 있는 기공 크기 분포가 생성됩니다(예: 그림 3).
8. 3D 인쇄 과정
- 샘플 컨테이너용 맞춤형 홀더를 3D 프린팅합니다(CAD 파일은 보충 파일 4-6 참조). 여기서, 조직 배양 플라스크 및 미세큐벳용 홀더가 사용됩니다. 홀더를 사용하면 프린터가 단일 인쇄 세션에서 여러 샘플을 인쇄하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 하이드로겔 배지가 있는 샘플 용기를 빌드 플랫폼의 홀더에 넣습니다.
- 3D 프린팅 소프트웨어를 엽니다. 사전 프로그래밍된 g-code를 소프트웨어에 로드합니다. 대표적인 결과를 위해 3.1단계를 사용하여 박테리아 현탁액을 3D 프린터에 로드합니다.
알림: 선형 수직 형상을 인쇄하기 위한 g-code의 예는 표 1에 나와 있습니다. - 3D 프린팅 소프트웨어를 통해 x-y-z 평면을 이동하여 프린트 헤드를 x-y 평면의 중앙에 배치하여 첫 번째 컨테이너가 되도록 한 다음 z축을 홈으로 이동합니다. 원점 복귀 z축은 프린트 헤드를 올립니다. 바늘 끝에 소량의 박테리아 현탁액이 보일 때까지 나사를 천천히 돌려 주사기 플런저를 누릅니다.
- 멸균 일회용 물티슈로 과도한 박테리아 현탁액을 가볍게 닦아냅니다. 시료 홀더, 바늘 및 주사기의 높이에 따라 3D 프린팅 소프트웨어를 사용하여 선택한 시료 용기의 하이드로겔 배지 안으로 프린트 헤드를 일정한 거리만큼 내립니다. 인쇄를 클릭하여 인쇄 프로세스를 시작합니다.
- 인쇄가 완료되면 샘플 용기를 닫습니다. 70% 에탄올로 프린터를 닦습니다. 주사기와 바늘을 적절하게 폐기하십시오.
9. V. cholerae의 성장 및 이미징
- 넓은 시야 이미징의 경우 줌 렌즈가 부착된 카메라를 사용하여 라이트박스로 이미지 셀 성장을 수행합니다. 실온에서 인쇄한 직후 샘플을 이미지화한 다음 인큐베이터로 전송합니다. 실험 중 이미징 세션 사이에 고정식 인큐베이터에서 샘플을 37°C로 유지합니다.
- 과립형 하이드로겔 매트릭스에서 장기간에 걸친 성장 거동을 관찰하기 위해 원하는 시간 동안 이미지를 캡처합니다.
Representative Results
과립형 하이드로겔 매트릭스가 있는 3D 바이오프린터를 사용하면 바이오프린터의 기능이 확장되어 박테리아 콜로니를 평평한 기판에 인쇄할 때 박테리아 현탁액의 낮은 점도로 인해 슬럼프가 되는 모양으로 프린팅할 수 있습니다. 여기에 제시된 접근 방식의 해상도는 압출 속도, 바늘 크기, 프린트 헤드 속도, 바늘 내 공기 및 박테리아 현탁액의 점도에 따라 다릅니다. 박테리아 현탁액의 부피가 적기 때문에 박테리아 현탁액을 주사기와 바늘에 로드하는 동안 기포가 부주의하게 유입될 수 있습니다. 이로 인해 최종 인쇄 구조에 기포가 증착될 수 있습니다(그림 4). 기포가 인쇄물에 유입되는 또 다른 방법은 인쇄하기 전에 플런저를 눌러 바늘 끝에 작은 박테리아 현탁액을 형성하지 않고 바늘 끝에 에어 갭이 존재하는 경우입니다. 인쇄하기 전에 주사기 플런저를 누르지 않으면 동일한 배치에서 다른 양의 세포가 인쇄될 수도 있습니다. 그러나 시간이 지남에 따라 그림 4와 같이 기포가 주변 매체에 용해됩니다.
압출 단계를 교정하기 위해 증착된 부피는 프린트 헤드의 선형 액추에이터가 주사기 플런저를 변환하는 방식에 따라 달라지며 주사기의 내경은 부피에 직접적인 영향을 미칩니다. 또한 박테리아 현탁액의 유변학적 특성은 바늘 수축을 통해 얼마나 쉽게 전단하여 매끄럽게 인쇄하는지에 영향을 미칩니다. 따라서 이 교정 절차는 모든 주사기/바늘/박테리아 현탁액 설정에 대해 다시 수행해야 합니다. 원칙적으로 주사기 교정은 자동화될 수 있습니다. 그러나 실제로 많은 사용 사례에 광범위하게 적용되는 코드를 작성하는 것은 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 1mL 주사기에서 약 300μL의 압출을 교정하려는 사용자는 30μL의 목표 부피 주변에서 교정하는 사용자보다 훨씬 더 자주 주사기를 다시 로드해야 합니다. 교정 프로세스가 시작될 때 E-step to volume 교정 상수를 알 수 없기 때문에 사용자는 실제로 얼마나 자주 재로딩이 필요한지 정확히 예측하지 못할 수 있습니다. 또한 교정 프로세스를 자동화하려면 사전 칭량된 각 1.5mL 튜브의 정확한 위치를 지정해야 합니다. 정확한 보정을 위해 모든 바이오잉크가 바늘에서 튜브로 증착되도록 하려면 바늘과 튜브 바닥/벽 사이에 정밀한 접촉이 이루어져야 합니다. 접촉이 잘 되지 않으면 작은 물방울이 젖은 상태로 남아 바늘에 부착될 수 있습니다. 따라서 튜브 사이의 위치 변화는 교정 프로세스의 오류에 크게 기여할 수 있습니다. 이러한 이유로 저자는 각 사용자가 고유한 요구 사항에 맞는 교정 프로그램을 구축할 것을 권장합니다.
여기에 제시된 접근 방식의 주요 특징은 이미징을 사용하여 운동성과 성장을 통해 환경을 통해 확산되는 박테리아를 직접 시각화할 수 있는 기능입니다. 이미징 프로토콜의 이전 버전에서는 6웰 플레이트가 19mL의 과립형 하이드로겔 매트릭스로 채워졌습니다. 그러나 도립 현미경으로 관찰할 수 있는 세포의 수평선을 3D 프린팅하는 데 성공하더라도 배지의 상단 표면에서도 조밀한 집락이 자라 명시야 현미경으로 시각화하는 데 제한이 있습니다(그림 5). 상단 표면의 콜로니는 인쇄 중에 주사기 바늘을 매체에 넣거나 제거할 때 오염으로 인해 발생했을 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해 세포의 수직선이 섬광 바이알에 인쇄됩니다(그림 6A). 그러나 원통형 바이알의 곡률은 이미징 중에 왜곡을 일으켰습니다. 이로 인해 인쇄를 위한 샘플 용기로 평평한 벽의 큐벳과 조직 배양 플라스크를 선택하여 왜곡 없는 이미징을 가능하게 했습니다(그림 6B-D). 조직 배양 플라스크의 한 가지 한계는 인쇄할 수 있는 형상을 제한하는 작고 기울어진 목입니다.
종합하면, 이 프로토콜을 사용하면 장기간에 걸쳐 복잡한 다공성 환경에서 박테리아 운동성과 성장을 관찰할 수 있습니다. 그림 6B-G에는 명시야 현미경을 사용한 V. cholerae의 생물막 형성 및 레이저 스캐닝 형광 컨포칼 현미경을 사용한 대장균의 플랑크톤 세포에 대한 몇 가지 예가 나와 있어 이 접근법의 다양성을 보여줍니다. 실제로, 하이드로겔 매트릭스의 잠재적인 문제는 형광 현미경을 사용하여 이미지화할 때 가능한 자가형광입니다. 그러나 그림 6F,G에 표시된 이미지는 여기에 제시된 실험 플랫폼에서 이러한 자가형광이 최소화되었음을 보여줍니다. 이러한 광학 현미경 접근 방식의 또 다른 한계는 ~100초 나노미터의 회절 한계에 의해 설정되는 공간 분해능입니다. 그러나, 이 길이 스케일은 개별 박테리아 세포의 크기보다 훨씬 작기 때문에, 광학 기술은 개별 세포의 스케일(그림 6G)에서 더 큰 다세포 콜로니(30,31,32,33)의 스케일까지 박테리아 세포를 이미지화할 수 있는 기능을 제공합니다. 추가 예는 아래에 설명되어 있습니다.
위에서 언급했듯이 여기에 제시된 접근 방식은 소량(1mL) 및 대형(20mL) 매트릭스 부피의 박테리아 콜로니를 3D 프린팅하고 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 서로 다른 부피를 사용하여 얻은 결과의 차이는 3D 프린팅된 운동성 및 비운동성 V. cholerae 콜레라 콜로니를 대표적인 예로 사용하여 아래에 설명되어 있습니다. 인쇄물의 공간 해상도(선의 너비)는 노즐의 내경에 의해 설정됩니다. 아래에 설명된 예에서 내경이 0.6mm인 바늘은 0.6mm의 초기 원통형 콜로니를 생성합니다. 이전 연구는 내경이 ~ 100-200 μm33 인 인발 유리 모세관을 사용하여 인쇄 해상도를 훨씬 더 줄일 수 있음을 입증했습니다.
소량의 경우, 두 개의 서로 다른 공극 크기 분포를 가진 두 개의 서로 다른 과립형 하이드로겔 매트릭스가 사용되는데, 하나는 V. cholerae 세포의 평균 직경(0.2-0.4μm36)보다 큰 평균 공극 크기를 가지며 다른 하나는 이 직경보다 작은 평균 공극 크기를 갖습니다. 12일 동안의 샘플은 시간 경과에 따른 군집의 면적 확장에 대한 이미지 분석을 통해 이미지화되고 측정됩니다(그림 7 및 그림 8). 세포 성장을 통해서만 주변을 통해 퍼질 수 있는 비운동성 세포의 경우, 조사된 서로 다른 매트릭스 간에 영역 확장 속도가 비슷했으며(그림 7), 이는 매트릭스 공극 크기의 차이가 예상대로 성장을 통한 세포 확산에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 대조적으로, 활성 운동성을 통해 주변을 통해 퍼진 운동성 세포의 경우, V. cholerae의 면적 팽창 속도는 더 큰 기공을 가진 하이드로겔 매트릭스에서 더 높았으며, 하이드로겔 입자에 의한 감금은 세포 운동성을 덜 방해했습니다. 박테리아 확산의 이러한 차이는 콜로니 형태에서도 분명했습니다(그림 8). 더 큰 기공을 가진 하이드로겔 매트릭스에서 V. cholerae의 콜로니는 매끄럽고 확산된 기둥을 통해 퍼져나갔으며(그림 8A), 이전에 관찰된 바와 같이 활성 운동성을 통한 퍼짐을 반영합니다32. 실제로, 이러한 해석과 일치하게, 이러한 확산 기둥은 비운동성 세포의 경우에는 관찰되지 않는다(그림 8C). 또한 기공은 세포가 모공을 통해 헤엄칠 때 구슬을 밀지 않을 만큼 충분히 큽니다. 또한, 수영에 의해 가해지는 점성 응력은 1Pa 미만으로 주변 하이드로겔 매트릭스를 눈에 띄게 변형시키기에는 불충분하다. 대조적으로, 더 작은 기공을 가진 하이드로겔 매트릭스의 콜로니는 운동성 및 비운동성 세포 모두에 대해 거칠고 프랙탈과 같은 기둥을 통해서만 확산되며(그림 8B,D), 세포 성장을 통해서만 확산되는 것을 반영하는 반면, 세포가 성장하면 일시적으로 변형되어 주변 매트릭스가 생성됩니다. 실제로, 하이드로겔 매트릭스의 항복 응력이 셀의 터고 압력보다 훨씬 작다는 점을 감안할 때, 작은 공극 크기의 한계에서 매트릭스는 세포 성장에 대한 약한 저항만 제공하고 이전 작업37에서 확인된 바와 같이 3D 프린팅 구조에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다.
대용량 샘플에서 수행된 실험에서도 유사한 결과가 관찰됩니다. 그러나 이러한 샘플에 영양소가 더 풍부하다는 점을 감안할 때 실험은 더 오랜 시간 동안 세포 성장을 유지할 수 있습니다. 예를 들어, 평균 공극 크기가 세포 크기보다 작은 과립형 하이드로겔 매트릭스를 사용한 결과가 표시되며, 따라서 세포 확산은 주로 성장에 기인합니다. 샘플은 과립형 하이드로겔 매트릭스에서 ~30일 동안 이미지화되고 처음 150시간 동안 비운동성 세포 및 운동성 세포 모두에 대해 유사한 면적 팽창을 관찰합니다. 그러나 더 긴 시간에는 샘플 간에 강한 변동성이 관찰되며 일부 샘플은 더 빠른 확산 속도를 나타냅니다(그림 9 및 그림 10). 흥미롭게도, 실험 후 하이드로겔 매트릭스를 다시 샘플링하면 (하이드로겔 매트릭스의 큰 부피의 이점) 항복 응력, 저장 계수 및 손실 계수의 감소가 측정되며(그림 11), 이는 매트릭스가 더 부드러워졌음을 나타냅니다. 이러한 변화는 V. cholerae 가 하이드로겔 매트릭스 특성을 변화시키고 장시간 세포 확산을 촉진하는 분자를 생산하기 때문일 수 있으며, 이는 향후 연구에서 테스트하기에 흥미로울 것입니다. 이러한 실험을 초래하는 거칠고 프랙탈과 같은 콜로니 형태의 예가 그림 10에 나와 있습니다.
그림 1: 맞춤형 3D 바이오프린터 이미지. (A) 일회용 Luer lock 주사기 및 바늘이 있는 수정된 주사기 펌프 압출기 헤드가 있는 바이오프린터. 바이오프린터의 너비는 ~46cm입니다. (B) 걸린 하이드로겔 매트릭스로 채워진 플라스크에 있는 세포의 3D 프린팅 이미지. 이미지의 너비는 87mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 과립형 하이드로겔 매트릭스의 유변학적 특성 분석. (A) 적용된 전단 속도의 함수로서의 전단 응력. (B) 저장 및 손실 계수, G' 및 G'', 각각 진동 주파수의 함수로. 범례는 각 하이드로겔 매트릭스를 제조하는 데 사용되는 하이드로겔 질량 분율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 두 개의 대표적인 과립형 하이드로겔 매트릭스의 공극 크기 측정. 추적자를 추적하여 각 하이드로겔 매트릭스에 대한 특징적인 공극 치수의 분포를 결정합니다. 데이터는 1-CDF로 표현되며, 여기서 CDF는 누적 분포 함수입니다. 범례는 각 매트릭스를 준비하는 데 사용되는 하이드로겔 질량 분율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 박테리아의 3D 프린팅 중에 형성된 기포의 예. (A) 이미징 설정의 개략도. (B) LB로 부풀어 오른 1.2% 하이드로겔 매트릭스의 인쇄물 하단(빨간색 상자)에 기포가 있는 V. cholerae 의 성장 스냅샷. 37°C에서 59시간 성장하면 기포가 완전히 용해되고 하이드로겔 매트릭스의 탄성으로 인해 콜로니가 다시 붕괴됩니다. 축척 막대 = 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: LB에서 부풀어 오른 1.2% 하이드로겔 매트릭스로 채워진 6웰 플레이트에 인쇄된 운동성 V. cholerae의 수평선과 37°C에서 48시간 배양 후 상단 표면에 형성된 생물막의 이미지. (A) 이미징 설정의 개략도. (B) 3D 프린팅 중 오염으로 인한 상단 표면의 생물막 형성은 불투명도를 감소시키고 수평선의 선명한 이미징을 허용하지 않습니다. 윗면에 주름이 생기는데, 이는 아마도 성장의 차이로 인한 것으로 추정된다. 축척 막대 = 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 이 분석법에서 사용할 수 있는 다양한 샘플 용기의 예. (A) 470시간 후 1.2% 과립형 하이드로겔 매트릭스로 채워진 유리 바이알에 인쇄된 V. cholerae. 바이알의 곡률은 성장을 이미징하기 어렵게 만듭니다. 척도 막대 = 5mm. (B) V. cholerae는 1.2% 과립형 하이드로겔 매트릭스로 채워진 마이크로 큐벳에 인쇄되었습니다. 편평한 측은 선명한 화상 진찰을 허용한다, 그러나 작은 양은 세포가 성장 기질을 다 떨어지기 전에 실험의 시간을 제한한다. (C) 1.2% 과립형 하이드로겔 매트릭스로 채워진 조직 배양 플라스크에 인쇄된 V. cholerae를 이미지화하기 위해 줌 렌즈를 사용한 이미징 설정. 마이크로 큐벳 케이스와 마찬가지로 평평한 면은 선명한 이미징을 가능하게 합니다. 조직 배양 플라스크는 더 많은 양의 과립형 하이드로겔 매트릭스로 채울 수 있으므로 실험 시간이 길어집니다. (D) 37°C에서 100시간 배양 후 1.2% 과립형 하이드로겔 매트릭스 내부에 인쇄된 V. cholerae의 줌 렌즈 이미지. 스케일 막대 = 1mm. (E) 형광 세포를 이미징하기 위한 컨포칼 현미경을 사용한 이미징 설정. (F) 37°C에서 10일 배양 후 1.2% 과립형 하이드로겔 매트릭스 내부의 형광 대장균 컨포칼 현미경 사진의 3D 투영. 척도 막대 = 50 μm. (G) 하이드로겔 매트릭스 내부의 형광 대장균의 단일 세포 분해능 공초점 현미경 사진. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 1mL의 과립형 하이드로겔 지지 매트릭스에 인쇄된 V. cholerae 콜로니의 시간 함수로 나타낸 면적 확장. 플롯의 데이터는 그림 8의 이미지 분석에서 가져온 것입니다. 운동성 세포(닫힌 빨간색 원과 사각형)는 비운동성 세포보다 더 빠른 속도로 퍼지는 것이 관찰되었으며, 이는 성장과 운동성 모두에 의한 확산을 반영합니다. 또한 공극 크기가 큰 하이드로겔 매트릭스의 운동성 세포(빨간색 사각형)는 0.3μm 기공(빨간색 원)이 있는 하이드로겔 매트릭스의 세포보다 더 빠른 속도로 퍼집니다. 비운동성 세포는 성장만 하기 때문에 두 공극 크기 간의 면적 팽창률에 차이가 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 1mL의 과립형 하이드로겔 지지 매트릭스에 인쇄된 V. cholerae 의 콜로니. (A) 기공 크기가 평균 세포 직경보다 큰 0.9% 과립형 하이드로겔 매트릭스에서 운동성 V. cholerae 의 성장 및 운동성의 스냅샷. 화살표는 하이드로겔 매트릭스를 통해 이동하는 세포로 인해 형성되는 확산 기둥을 나타냅니다. (B) 공극 크기가 평균 세포 직경보다 작은 1.2% 과립형 하이드로겔 매트릭스에서 운동성 V. cholerae 의 성장 및 운동성의 스냅샷. 화살표는 세포 성장으로 인해 형성되는 거칠고 프랙탈 같은 기둥을 나타냅니다. (C) 공극 크기가 평균 세포 직경보다 큰 0.9% 과립형 하이드로겔 매트릭스에서 비운동성 V. cholerae 의 시간 진화에 대한 스냅샷. 이 경우 운동성을 반영하는 확산 기둥은 관찰할 수 없습니다. (D) 공극 크기가 평균 세포 직경보다 작은 1.2% 과립형 하이드로겔 지지 매트릭스에서 비운동성 V. cholerae 의 성장에 대한 스냅샷. 이 경우 성장을 반영하는 거칠고 프랙탈 같은 기둥이 다시 관찰됩니다. 축척 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 20mL의 1.2% 과립형 하이드로겔 지지 매트릭스에 인쇄된 V. cholerae 콜로니의 시간 함수로 나타낸 면적 확장. 비운동성 세포(열린 원)와 운동성 세포(닫힌 원)는 처음 100시간 동안 비슷한 속도로 퍼지는 것으로 관찰됩니다. 100시간 후에는 면적 팽창률의 차이가 관찰되는데, 이는 장시간의 변동성 변화로 인한 것일 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 37°C에서 성장한 1.2% 과립형 하이드로겔 매트릭스 22mL에 인쇄된 V. cholerae 콜로니. (위) 운동성 V. cholerae의 성장 스냅샷. (하단) 비운동성 V. cholerae의 성장에 대한 스냅샷. 두 경우 모두 성장을 반영하는 거칠고 프랙탈 같은 기둥이 관찰됩니다. 축척 막대 = 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 실험 전(0시간)과 실험 후(397시간)의 1.2% 과립형 하이드로겔 매트릭스의 유변학적 특성 분석. (A) 적용된 전단 속도의 함수로서의 전단 응력. (B) 저장 및 손실 계수, G' 및 G''는 각각 적용된 발진 주파수의 함수입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| Gcode 명령 | 작업 | |||
| M82 시리즈 | 절대 압출 모드 | |||
| M302 S0 | 냉간 압출 사용 | |||
| M92 E14575 | mm당 돌출 단계 설정 | |||
| G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 | z축과 돌출 위치를 0으로 설정하고 x-,y- 위치를 35.71mm로, g-code가 시작될 때 프린트 헤드가 있는 y 88mm로 설정합니다. | |||
| M221 S100 T0 | 유량을 100%로 설정합니다. | |||
| M107 시리즈 | 팬 끄기 | |||
| G1 F1 X35.61 Y81 E0.1 | 20 μL의 바이오잉크를 현재 위치가 설정된 50 μL/min의 이송 속도로 매트릭스 안으로 압출합니다. | |||
| G0 F200 Z60 | 매트릭스에서 바늘을 당겨 빼내고 200mm/min의 속도로 샘플을 채취합니다. | |||
| G0 F500 X65.81 Y81.0 | 니들을 500mm/min의 속도로 다음 샘플 콘테이너로 이동합니다. | |||
| G0 F100 Z0 | 니들을 다음 샘플 콘티에이너에 넣어 100mm/min의 속도로 인쇄가 시작된 동일한 z 위치로 내립니다. | |||
| G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2 | 20 μL의 바이오잉크를 현재 위치가 설정된 50 μL/min의 이송 속도로 매트릭스 안으로 압출합니다. | |||
| G0 F200 Z60 | 매트릭스에서 바늘을 당겨 빼내고 200mm/min의 속도로 샘플을 채취합니다. | |||
| G0 F500 X96.01 Y81.0 | 니들을 500mm/min의 속도로 다음 샘플 콘테이너로 이동합니다. | |||
| G0 F100 Z0 | 100mm/min의 속도로 인쇄가 시작된 동일한 z 위치로 바늘을 샘플 컨티에이너에 내립니다. | |||
| G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3 | 20 μL의 바이오잉크를 현재 위치가 설정된 50 μL/min의 이송 속도로 매트릭스 안으로 압출합니다. | |||
| G0 F200 Z60 | 매트릭스에서 바늘을 당겨 빼내고 200mm/min의 속도로 샘플을 채취합니다. | |||
| G0 F500 X126.21 Y81.0 | 니들을 500mm/min의 속도로 다음 샘플 콘테이너로 이동합니다. | |||
| G0 F100 Z0 | 니들을 다음 샘플 콘티에이너에 넣어 100mm/min의 속도로 인쇄가 시작된 동일한 z 위치로 내립니다. | |||
| G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4 | 20 μL의 바이오잉크를 현재 위치가 설정된 50 μL/min의 이송 속도로 매트릭스 안으로 압출합니다. | |||
| G0 F200 Z80 | 매트릭스에서 바늘을 당겨 빼내고 200mm/min의 속도로 샘플을 채취합니다. | |||
표 1: 박테리아 현탁액의 수직선을 인쇄하기 위한 G 코드 프로그래밍.
보충 파일 1: 주사기 압출기용 하단 클램프 1mL 일회용 루어 잠금 주사기용 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 주사기 압출기용 1mL 일회용 루어 잠금 주사기용 상단 클램프용 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3: 주사기 압출기용 1mL 일회용 루어 잠금 주사기용 주사기 어댑터용 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4: 큐벳 샘플 홀더용 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 5: 조직 플라스크 샘플 홀더용 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 6: 6웰 플레이트 및 35mm 페트리 접시 프린트 베드용 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 7: 입자 추적을 위한 사용자 정의 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
프로토콜의 중요한 단계
각 하이드로겔 매트릭스를 준비할 때 매트릭스가 멸균 환경에서 만들어지는지 확인하는 것이 중요합니다. 그렇지 않은 경우 오염이 발생할 수 있으며, 이는 예를 들어 며칠 후 매트릭스에서 미세 콜로니(작은 스페로이드)로 나타납니다. 혼합 과정에서 모든 건조 입상 하이드로겔 입자가 용해되는 것이 중요합니다. 또한 NaOH로 각 하이드로겔 매트릭스의 pH를 조정하면 과립이 팽창하기 시작하여 하이드로겔 매트릭스의 점도가 증가하여 혼합이 더 어려워집니다. 스탠드 믹서를 사용하면 NaOH가 하이드로겔 매트릭스에 잘 혼합되도록 하는 데 도움이 됩니다. 각 박테리아 현탁액을 로드하는 동안 바늘에 공기 주머니가 형성될 수 있습니다. 이 문제를 방지하려면 바늘 끝이 항상 튜브 바닥이나 상단 표면 근처가 아닌 원심분리기 튜브의 박테리아 현탁액에 있어야 합니다. 이 문제를 극복하는 또 다른 방법은 많은 양의 세포를 성장시켜 인쇄를 위한 박테리아 현탁액을 더 많이 갖는 것입니다.
제한
현재, 프린팅 중에 박테리아 현탁액의 낮은 점도는 프린팅할 수 있는 형상을 제한하고 종종 미량 세포로 인해 하이드로겔 매트릭스 표면의 상단에 생물막 형성 및 성장으로 이어집니다. 박테리아 현탁액의 점도를 높이거나 3D 프린터 설정을 더욱 최적화하는 등 이러한 한계를 극복할 수 있는 몇 가지 잠재적인 방법이 있습니다. 박테리아 현탁액의 점도를 증가시키기 위해, 박테리아 현탁액을 다른 중합체(예를 들어, 알긴산)와 혼합할 수 있는데, 이는 평평한 표면(38) 상에 박테리아의 3D 프린팅을 위해 이전에 사용되어 왔다. 프린터 설정은 과립형 하이드로겔 매트릭스에서 바늘을 빼내는 동안 주사기 플런저를 수축할 수 있도록 추가로 최적화할 수 있으며, 이는 하이드로겔 매트릭스에서 바늘을 제거하는 동안 세포가 침착되는 것을 막을 가능성이 있습니다.
기존/대체 방법과 비교한 방법의 중요성
여기에 설명된 방법은 박테리아 콜로니를 과립형 하이드로겔 매트릭스로 인쇄할 수 있습니다. 과립형 하이드로겔 매트릭스를 사용하면 외부 환경 요인(예: 기공 크기, 매트릭스 변형성)이 박테리아의 운동성과 성장에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 또한, 이 연구에서 LB는 하이드로겔 매트릭스를 팽창시키기 위한 액체 성장 배지로 사용되는 반면, 하이드로겔 매트릭스는 항생제가 함유된 배지를 포함한 다른 액체 성장 배지로 팽창될 수 있습니다. 제한된 환경에서 박테리아를 연구하는 이전 방법은 실험 시간의 길이, 폴리머 메쉬 크기 및 주변 하이드로겔 매트릭스 강성37,38에 의해 제한되었습니다. 다양한 폴리머로 과립형 하이드로겔 매트릭스를 만들기 위한 프로토콜이 이미 존재하므로 박테리아의 운동성과 성장에 대한 다양한 환경 조건의 영향을 연구할 수 있는 잠재력은 무궁무진합니다. 이 방법을 사용하면 숙주 점액이나 토양과 같이 박테리아가 실제 세계에 서식하는 환경을 보다 쉽게 재현할 수 있는 제어 환경에서 박테리아를 연구할 수 있습니다. 다른 많은 방법의 또 다른 한계는 주변 매트릭스의 불투명도입니다. 그러나 광학적으로 투명한 재료를 사용하는 이 접근 방식은 예를 들어 3D에서 박테리아의 광유전학적 제어 및 패터닝을 탐색할 수 있는 기능을 제공합니다.
운동성과 성장을 연구하는 것 외에도, 여기에 설명된 3D 프린팅 방법은 기판에 바이오잉크를 증착해야 하는 다른 많은 바이오프린팅 방법의 한계를 극복하여 생산할 수 있는 공학적 생체 물질의 높이가 제한됩니다. 미래에는 이 바이오프린팅 프로토콜이 더욱 확장되어 폴리머와 바이오필름 형성 세포를 혼합하여 바이오하이브리드 재료를 제조할 수 있습니다. 과립형 하이드로겔 매트릭스는 현재의 다른 많은 박테리아 바이오프린팅 방법보다 더 두껍고 더 큰 규모의 엔지니어링 살아있는 물질과 더 복잡한 형상을 3D 프린팅할 수 있도록 지원합니다. 이 연구에서는 콜레라균(V. cholerae )과 대장균(E. coli )만 사용했지만, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa )과 같은 다른 종도 3D 프린팅에 성공했다37. 인쇄 외에도 프린터는 예를 들어 유전적 변화가 있는지 확인하기 위해 성장 후 박테리아의 제어된 샘플링을 수행하도록 조정할 수 있습니다.
Disclosures
이 간행물에서 박테리아 군집을 3D 프린팅하고 이미지화하는 데 사용된 실험 플랫폼은 Tapomoy Bhattacharjee 및 S.S.D.(PCT 출원 번호 PCT/US/2020/030213)를 대신하여 프린스턴 대학교가 제출한 특허 출원의 대상입니다.
Acknowledgments
R.K.B.는 대통령 박사후 연구원 프로그램의 지원을 인정합니다. 이 자료는 또한 NSF 대학원 연구 펠로우십 프로그램 보조금 DGE-2039656(AMH에)의 지원을 받는 작업을 기반으로 합니다. A.S.D.-M. 그리고 HLL은 프린스턴 대학의 Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 V. cholerae의 균주를 제공해 준 Bonnie Bassler의 실험실에 감사드립니다. S.S.D.는 NSF 보조금 CBET-1941716, DMR-2011750 및 EF-2124863, Eric and Wendy Schmidt Transformative Technology Fund, New Jersey Health Foundation, Pew Biomedical Scholars Program 및 Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| 1 mL Luer lock syringe | BH Supplies | BH1LL | |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| 100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres) | Invitrogen, (ThermoFischer Scientific) | F8803 |
|
| 15 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-237 | |
| 20 G blunt needle | McMaster Carr | 75165A252 | |
| 25 mL tissue culture flasks | VWR | 10861-566 | |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot Mini 2 | |
| 3D printing software | Cura | Cura-Lulzbot | |
| 50 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-239 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Carbomer Granular Hydrogel Particles | Lubrizol | Carbopol 980NF | dry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers |
| Centrifuge (2 mL tube capacity) | VWR | 2405-37 | |
| Centrifuge (50 mL tube capacity) | ThermoFischer Scientific | 75007200 | Sorvall (brand) ST 8 (model) |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R+ inverted laserscanning confocal microscope |
|
| Glass bottom petri dish | Cellvis | D35-10-1-N | |
| Lennox LB (Lubria Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap | McMaster Carr | 91290A478 | |
| M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex Nut | McMaster Carr | 93187A300 | |
| Open-source syringe pump | Custom-made | Replistruder 4 | https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791 |
| Petri dish (60 mm round) | ThermoFischer Scientific | FB0875713A | |
| Shear Rheometer | Anton Paar | MCR 501 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-992 |
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