여기서는 각막을 자극하는 감각 섬유를 손상시키는 세 가지 방법을 제안합니다. 이러한 방법은 생쥐의 축삭 재생에 대한 연구를 용이하게 합니다. 다른 동물 모델에 적용할 수 있는 이 세 가지 방법은 각막 신경 분포 생리학 및 재생 연구에 이상적입니다.
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이 논문에서
요약
초록
각막은 눈을 덮고 있는 투명한 조직으로 선명한 시력에 매우 중요합니다. 그것은 신체에서 가장 신경 분포가 심한 조직입니다. 이 신경 분포는 눈에 감각과 영양 기능을 제공하고 각막을 온전하게 보존하는 데 기여합니다. 이러한 신경 분포의 병리학적 파괴를 신경 영양성 각막염이라고 합니다. 이것은 눈 부상, 수술 또는 질병에 의해 유발될 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 클리닉에서 일반적으로 접하는 세 가지 유형의 사례를 요약하는 방식으로 신경 자극에 손상을 입히기 위한 세 가지 프로토콜을 제안합니다.
첫 번째 방법은 안과 버로 상피를 마모시키는 것입니다. 여기에는 상피층, 자유 신경 말단 및 기저하 신경총을 제거하는 것이 포함되며 클리닉에서 수행되는 광굴절 각막 절제술 수술과 유사한 방식으로 수행됩니다. 두 번째 방법은 상피의 무결성을 유지하면서 생검 펀치로 주변부를 절개하여 신경 분포만을 표적으로 합니다. 이 방법은 라멜라 각막 성형술의 첫 번째 단계와 유사하며 신경 분포의 퇴화와 중앙 각막의 축삭의 재성장으로 이어집니다. 마지막 방법은 형광 신경 섬유의 소작 부위를 특이적으로 국소화하는 다광자 현미경을 사용하여 형질전환 마우스 모델의 신경 분포를 손상시킵니다. 이 방법은 자외선에 과도하게 노출되는 광각막염과 동일한 손상을 입힙니다.
이 연구는 각막 신경 분포의 생리병리학, 특히 축삭의 퇴화 및 재생을 조사하기 위한 다양한 옵션을 설명합니다. 재생을 촉진하는 것은 상피 결손이나 각막 천공과 같은 합병증을 피하는 데 매우 중요합니다. 제안된 모델은 신경 재생을 강화하고 질병 진행을 제한하는 새로운 약리학적 분자 또는 유전자 요법을 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.
서론
눈의 투명한 표면인 각막은 상피, 기질, 내피의 세 가지 층으로 구성되어 있습니다. 이 기관은 신체에서 가장 높은 밀도의 신경 분포를 가지며 주로 삼차 신경절의 안과 분지에서 유래한 감각 섬유(Aδ 및 C 유형)로 구성됩니다. 감각 섬유는 간질 중간의 각막 주변부를 뚫고 표면을 덮기 위해 가지를 뻗는 큰 다발 형태로 침투합니다. 그런 다음 두 갈래로 갈라져 보우만 막을 뚫고 각막 중앙에 소용돌이가 형성되어 쉽게 알아볼 수 있는 기저하신경총을 형성합니다. 이러한 섬유는 상피의 외부 표면에서 자유 신경 말단으로 끝납니다. 그들은 열적, 기계적, 화학적 자극을 전달하고 상피 항상성에 필수적인 영양 인자를 방출할 수 있습니다 1,2. 신경영양성 각막염(NK)은 각막 감각 신경 분포에 영향을 미치는 퇴행성 질환입니다. 이 희귀 질환은 각막 민감도가 감소하거나 상실되어 눈물 생성이 감소하고 각막의 치유 특성이 저하되기 때문에 발생한다3. NK는 상피 결손이 생기는 1기부터 기질 융해 및/또는 각막 천공이 발생하는 3기까지 3단계로 진행된다4.
임상적으로 이 질병의 ....
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프로토콜
모든 실험은 국립 동물 실험 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 준비
- 마취를 위해 케타민-자일라진 마취액을 준비합니다. 멸균 0.9% NaCl 2,175mL에 케타민(100mg/mL) 200μL와 자일라진 125μL(20mg/mL)를 희석하여 케타민 80mg/kg, 자일라진 10mg/kg을 주입합니다.
- 멸균 0.9% NaCl 1,400mL에 0.3mg/mL 부프레노르핀 100μL를 첨가하여 진통제로 0.02mg/mL 부프레노르핀 용액을 준비합니다.
- 형광 염색 용액을 준비합니다.
- 미세한 저울을 사용하여 10mg의 플루오레세인 염을 칭량하고 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석하여 0.1% 플루오레세인 용액을 얻습니다.
- 용액을 빛으로부터 보호하고 5분 동안 흔듭니다. 10mL 주사기와 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.
알림: 형광 용액은 빛으로부터 보호되어야 하며 +4°C에서 5일 동안 보관할 수 있습니다.
- 마우스 준비
- 마우스의 무게를 잰 후 마취액의 마우스 무게(MW) 10μL/g을 복강내 주사하여 마취를 유도합니다. 마우스가 움직....
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결과
이 연구는 생쥐의 각막 신경 분포에 손상을 입히기 위한 몇 가지 프로토콜을 제안합니다. 상피 치유의 생리병리학을 조사하기 위해 유사한 프로토콜이 사용되었지만, 우리는 각막 신경 분포 재생을 조사하는 새로운 방법을 채택하고 개발하기로 결정했습니다. 신경 분포를 관찰하기 위해 두 가지 기술을 사용했습니다. 먼저, 면역형광 기법을 사용하여 범 뉴런 항체(BIII tubulin)와 인터컬레이터로 핵을 사용하여 신경 섬유를 염색했습니다. 둘째, 신경 섬유에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 마우스 균주를 활용했습니다. 각막은 형광 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다.
첫 번째 방법은 각막 상피층을 제거하기 위해 0.5mm의 녹 고리 제거제가 있는 안과용 버를 사용했습니다(그림 1A). 이 연구는 재생에 관련된 세포 및 분자 구성 요소를 이해하는 수단으로 상피 내부에 위치한 신경 분포에 가해지는 손상에 중점을 둡니다. 수술 전에는 기저 .......
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토론
신경영양성 각막염은 10,000명 중 5명에게 영향을 미치는 희귀 질환으로 간주됩니다. 그러나 화학적 화상과 같은 신체적 손상이나 당뇨병, 다발성 경화증과 같은 증후군으로 인해 NK를 앓고 있는 사람은 이러한 통계에 포함되지 않는다3. 더욱이, 이 질환은 여전히 현저하게 과소 진단되고있으며22 이 질병의 유병률은 과소평가되고 있다. 환자의 시력을 보존하는 수단으로 축삭 재생을 촉진하는 새로운 치료법과 치료법이 절실히 필요합니다. 현재 NK의 초기 단계인 환자에게 제공되는 유일한 치료법은 각막 신경 재생을 지원하는 약리학적 점안액 23,24,25를 사용하는 것입니다. 그러나 이것들은 특정 지점까지만 효과적입니다. 궤양과 같은 각막의 더 심각한 변형의 경우, 양막 이식 또는 각막 성.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 형질전환 마우스 계통 MAGIC-Markers에 대한 접근에 대해 Karine Loulier 박사에게 감사를 표합니다. 저자들은 또한 프랑스 국립 연구국(ANR-10-INBS-04, "Investments for the future")이 지원하는 France-BioImaging 국가 인프라의 회원인 RAM-Neuro 동물 핵심 시설과 이미징 시설 MRI에 감사를 표합니다. 이 연구는 ATIP-Avenir 프로그램, Inserm, Région Occitanie, 몽펠리에 대학교, 프랑스 국립 연구 기관(ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale(FRM 재생 의학, REP202110014140) 및 Groupama Foundation의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 & 마이크로; m seringe 필터 | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm 러스트 링 제거제 | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL 플라스틱 튜브 | Eppendrof | ||
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin 항체 | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| 인공 눈물 | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| 면봉 | 모든 공급자 | N/A | |
| 해부 도구 | Fine Science Tools | N/A | |
| 플루오레세인 | Merck | 103887 | |
| 냉수 생선 피부의 젤라틴 | 시그마 | G7765 | |
| 염소 세럼 | Merck | S26 | |
| 헤드 홀더 | Narishige | SGM 4 | |
| 가열판 | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | 프랑스 시판 허가 번호: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | LVCC(Large Volume Computational Clearing ) 프로세스 |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| 레이저 파워 미터 | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager 조직 현미경 | Leica | N/A | |
| 다광자 Zeiss LSM 7MP 정립 현미경 | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| 파라메트릭 발진기 | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue 코발트 필터 캡 | Bernell | ALPEN | |
| 페트리 접시 | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy 프로토콜 |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | 각막 전체 마운트 처리 |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | 프랑스 시판 허가 번호: FR/V/8146715 2/1980 |
| 멸균 생검 펀치 2.5mm | LCH 의료 | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | 장착 매체 |
참고문헌
- Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. Anatomy of the human corneal innervation. Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).
- Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762(2019).
- Dua, H. S., et al.<....
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재인쇄 및 허가
