이 논문의 초점은 환경에서 획득한 까다로운 혐기성 미생물을 위한 배지를 만들기 위한 모범 사례를 자세히 설명하는 것입니다. 이러한 방법은 혐기성 배양을 관리하는 데 도움이 되며 찾기 어려운 배양되지 않은 미생물인 "미생물 암흑 물질"의 성장을 지원하는 데 적용할 수 있습니다.
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방법 논문
환경적으로 획득한 혐기성 미생물을 배양하기 위한 In Situ Informed Simulated Medium 형식 세트
이 논문에서
요약
초록
혐기성 미생물의 배양 의존적 연구는 방법론적 역량에 달려 있습니다. 이러한 분석법은 혐기성 미생물에 적합한 성장 조건(예: pH 및 탄소원)을 만들고 유지하는 동시에 인공 환경을 손상시키지 않고 샘플을 추출할 수 있어야 합니다. 이를 위해 현장 환경에 의해 정보를 얻고 시뮬레이션하는 방법은 해당 환경에서 미생물을 배양하는 데 큰 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 지상 표면 및 지하 미생물을 배양하기 위한 현장 정보 및 시뮬레이션 혐기성 방법을 간략하게 설명하고 교란을 최소화한 혐기성 샘플 수집을 강조합니다. 이 프로토콜은 맞춤형 혐기성 액체 배지의 생산과 혐기성 미생물의 환경 획득 및 시험관 내 성장에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 환경적으로 획득한 배양을 위한 퇴적물 및 혐기성 액체 매체의 환경 시뮬레이션에 사용되는 혐기성 생물반응기의 중요한 구성 요소를 다룹니다. 우리는 실험적 탄소원에 반응하여 활성 배양이 동적으로 조정되는 생물반응기의 수명 동안 유지된 마이크로바이옴의 예비 차세대 염기서열 분석 데이터를 포함했습니다.
서론
대부분의 미생물은 배양되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이것은 한천 플레이트를 사용하여 성공적으로 배양된 소수의 미생물과 대조되는 현미경을 통해 관찰된 세포 간의 큰 불균형에 의해 뒷받침됩니다. 스탈리(Staley)와 코놉카(Konopka)는 이 차이를 "판금 카운트 변칙(Great Plate Count Anomaly)"이라고 명명했다.[1] 추정된 설명되지 않은 다양성은 여러 다른 환경에서 순위 풍부도 곡선에 분포된 많은 새로운 속을 보여주는 메타게놈 및 메타전사체 데이터에 의해 뒷받침된다2. 관찰되었지만(일반적으로 미생물 군집의 무작위 샷건 시퀀싱에 의해) 배양되지 않은 미생물은 "미생물 암흑물질"(microbial dark matter)이라고 불립니다.3,4.
-omics의 시대에 미생물 배양은 게놈 데이터를 완전히 평가하고 존재하는 유전자의 기능/표현형을 검증하는 데 필수적입니다. 배양된 미생물의 염기서열 분석은 샷건 균유전체학(shotgun metagenomics) 및 환경으로부터 메타게놈 조립 게놈(met....
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프로토콜
1. 맞춤형 혐기성 액체 매체 생산
- 배양병용 배지(500mL 생산)
- 화합물을 측정하여 1L 병에 추가하고 판독기의 관심 배양액에 해당하는 표 1 의 컬럼을 사용하여 pH를 조정합니다( 표 1 의 양은 1,000mL 생산에 대해 기록되었으므로 그에 따라 조정). 병을 휘저어 균질하게 화합물을 혼합합니다.
- 병을 전자레인지에 5-6분 동안 돌려 액체를 끓입니다. 전자레인지를 자주 열고 내열 장갑을 사용하여 액체를 부드럽게 휘젓습니다. 거품이 난 후 액체가 잠잠해지면 전자레인지를 빠르게 엽니다. 그렇지 않으면 액체가 빠르게 팽창하여 병이 넘칠 수 있습니다.
- 멸균 10mL 유리 피펫을N2 가스 매니폴드 설정에 부착합니다(Balch et al.11의 설계를 기반으로 함, 순도의N2 가스에 대해 가열된 구리 컬럼이 필요하지 않음, 자세한 가스 매니폴드 정보는 보충 파일 1 참조). 매니폴드를 열어O2 를 배출하고N2 가스가 흘러나오도록 합니다.
- 피펫 팁을 액체에 넣고 기포가 적....
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결과
여기에서, 우리는 본원에 기술된 바와 같은 시추공 혼합 배양 배지 제조방법 및 생물반응기 셋업 방법을 사용한 생물반응기 연구의 결과를 나타낸다. 시추공 혼합 배양 배지는 산화적 열수 용해(OHD)13,14에 의해 처리된 옥수수 속대의 슬러리를 탄소원으로서 함유하도록 변형되었다. 개질된 시추공 혼합 배양 배지를 0.4mL/분의 속도로 44일 동안 생물반응기로 펌핑하였다. 23일째에는 미국 네바다주 데스밸리 지역의 시추공 BLM-1에서 채취한 접종물15개가 추가됐다. 생물반응기로부터의 액체 샘플은 1일, 8일, 15일, 22일, 23일(접종 후), 30일, 37일 및 44일에 샘플링 캐치 보틀에서 수집하였다.
접종 배양물(및 생물반응기 퇴적물의 접종 전 오토클레이브 생존 거주자)의 일반적인 상태를 추적하기 위해 생물반응기 액체 샘플을 직.......
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토론
이 프로토콜의 중간 생산 섹션(섹션 1)은 출판 이후 널리 사용되어 온 Miller and Wolin17의 수정된 Hungate 기법에 그 구조를 빚지고 있습니다. 이 확장된 프로토콜의 실용성은 서술적 특성과 미생물의 현장 획득과의 결합에서 비롯됩니다. 환경에 대한 정보를 제공하고 시뮬레이션된 배지를 포함하는 배양병은 혐기성 지하 박테리아 Thermoanaerosceptrum fracticalcis 균주 DRI1318, Caldiatribacterium inferamans 균주 SIUC1(등록 번호 MT023787; 준비 중인 원고) 및 Anaerothermus hephaesti를 현장에서 획득한 이전 구성원을 성공적으로 배양하는 데 사용되었습니다 균주 SIUC3 (등록 번호 MK618647; 준비 중인 원고) 및 혐기성 지하 박테리아 특성화되지 않은 균주 DRI1.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 수년에 걸쳐 이러한 기술에 영향을 미치거나 발전시킨 정보와 멘토링의 계보를 인정하고 싶습니다. 전직 대학원생, 박사 후 연구원 및 현재 교수인 Hamilton-Brehm 박사는 시간을 내어 혐기성 기술을 가르친 Mike Adams 박사, Gerti Schut 박사, Jim Elkins 박사, Mircea Podar 박사, Duane Moser 박사 및 Brian Hedlund 박사에게 감사의 빚을 지고 있습니다. 국제자연보호협회(Nature Conservancy)와 아메리칸 리버스(American Rivers)는 각각 G21-026-CON-P 보조금과 AR-CE21GOS373 보조금을 통해 이 작업을 지원했습니다. 이 논문에 표현된 모든 의견, 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 Nature Conservancy 또는 American Rivers의 견해를 반영하는 것은 아닙니다. 이 연구는 SIU Advanced Energy Institute의 보조금으로 지원되었으며, SIU Advanced Energy Institute는 Advanced Energy Resource Board를 통해 수여된 자금 지원에 감사를 표합니다. NGS는 LC Sciences에서 수행했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate 병 | Fisher Scientific | ||
| 1 mL 주사기(슬립 팁 포함 | ) Fisher Scientific | ||
| 10 mL 유리 피펫 | Fisher Scientific | ||
| 100 mL 배양 병 | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm 핸드 크림퍼 | Fisher Scientifc | ||
| 23G 바늘 | Fisher Scientifc | ||
| 500mL 붕규산 병 | Fisher Scientific | ||
| 알루미늄 씰 | Fisher Scientifc | ||
| 캐뉼라, 길이 31.5cm | Fisher Scientific | ||
| 캐뉼라, 길이 6cm | Fisher Scientifc | ||
| Corer | 기딩스 머신 컴퍼니 | 회사 부품으로 조립 | |
| 가스 매니폴드 | 스웨즈락 | 다양한 부품으로 조립 | |
| 라이터 | Lowe's | ||
| N2 가스 | 에어가스 | ||
| 니트릴 장갑 | Fisher Scientific | ||
| 고무 마개(GL45 병용) | Glasgeratebau OCHS | ||
| 고무 마개(배양병용) | 에이스 글라스 | ||
| 교반 핫 플레이트 | 코닝 | ||
| 미량 미네랄, | ATCC | ||
| 비타민 | ATCC | ||
| 스트롱>바이오리액터 특화 재료 | |||
| #10 고무 스토퍼 | , 에이스 글라스 | ||
| #7 고무 마개 | Fisher Scientifc | ||
| 1mL 주사기(루어 잠금 팁 포함 | ) Fisher Scientifc | ||
| 1/4" 호스 미늘 볼 밸브 | Amazon | ||
| 10mL 주사기(루어 잠금 팁 포함 | ) Fisher Scientifc | ||
| 3.5L 붕규산 병 | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" 호스 미늘 어댑터 피팅 | 아마존 | ||
| 60 mL 주사기와 루어 잠금 팁 | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| GL14 오픈 탑 캡 용 앵글 호스 커넥터 | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate 생물 반응기 | Allen Scientific Glass | 요청 시 맞춤 제작 | |
| 드릴 | Lowe's | ||
| Female luer lock 어댑터 커플러 | Amazon | ||
| GL14 오픈 탑 캡 | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 오픈 탑 캡 | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 오픈 탑 캡 | Ace Glass | ||
| PTFE GL14 오픈 탑 캡 Ace용 실리콘 격막 | 유리 | 7625-06 | |
| PTFE GL18 오픈 탑 캡 용 실리콘 격막 | 에이스 유리 | 7625-07 | |
| 링 스탠드 | Fisher Scientific | ||
| 링 스탠드 체인 클램프 | 아마존 | ||
| 링 스탠드 클램프 | Fisher Scientific | ||
| 실리콘 튜브; 1/4 "id, 1/2"od | Grainger | 55YG13 | |
| 실리콘 튜브; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| 직선 호스 커넥터 GL14 오픈 탑 캡 | 에이스 글래 | 7623-22 | |
| 삼방향 스톱콕 | 아마존 | ||
| 양방향 스톱콕 | 아마존 | ||
| 초저 유량 가변 유량 미니 펌프 | VWR | ||
| 수조 | 피셔 Scientifc | ||
| 13-18mm 외경 튜브용 흰색 고무 격막 | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| 지퍼 타이 | Lowe's |
참고문헌
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L.
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