수경 재배 조건에서 Arabidopsis thaliana 뿌리에 대한 박테리아 집락 측정
Summary
뿌리권에서 식물 성장 촉진 rhizobacteria (PGPR)의 식민지화는 성장 촉진 효과에 필수적입니다. 세균성 rhizosphere colonization의 검출 방법을 표준화 할 필요가 있습니다. 여기에서는 뿌리 표면의 박테리아 집락을 정량화하기 위한 재현 가능한 방법을 설명합니다.
Abstract
애기장대(Arabidopsis thaliana) 뿌리에 대한 박테리아 집락을 측정하는 것은 식물-미생물 상호 작용 연구에서 가장 빈번한 실험 중 하나입니다. rhizosphere에서 박테리아 집락을 측정하기 위한 표준화된 방법은 재현성을 향상시키기 위해 필요합니다. 우리는 먼저 수경 재배 조건에서 멸균 A.thaliana를 배양 한 다음 뿌리 구의 박테리아 세포를0.01의 OD 600의 최종 농도로 접종했습니다. 접종 2일 후에, 뿌리 조직을 채취하고 멸균수로 3회 세척하여 집락화되지 않은 세균 세포를 제거하였다. 그런 다음 뿌리의 무게를 측정하고 뿌리에 서식하는 박테리아 세포를 소용돌이로 수집했습니다. 세포 현탁액을 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액으로 그래디언트로 희석한 후 Luria-Bertani(LB) 한천 배지에 도금했습니다. 플레이트를 37°C에서 10시간 동안 배양한 후, LB 플레이트의 단일 콜로니를 계수하고 정규화하여 뿌리에 콜로니화된 박테리아 세포를 나타냈습니다. 이 방법은 단일-상호 작용 조건에서 rhizosphere의 박테리아 집락을 감지하는 데 사용되며 재현성이 우수합니다.
Introduction
단일 박테리아 균주에 의한 rhizosphere colonization을 감지하기 위한 정량적 및 정성적 방법이 있습니다. 정성적 방법의 경우 형광을 구성적으로 표현하는 균주를 사용해야 하며 형광 분포 및 강도는 형광 현미경 또는 레이저 공초점 기기 1,2에서 검사해야 합니다. 이러한 전략은 현장 박테리아 집락화(bacterial colonization in situ3)를 잘 반영할 수 있지만, 정량화에서 기존의 플레이트 계수 방법만큼 정확하지는 않습니다. 게다가, 현미경으로 부분적인 뿌리 영역만 표시하는 제한으로 인해 때때로 주관적인 편향의 영향을 받을 수 있습니다.
여기에서는 집락화된 박테리아 세포를 수집하고 플레이트의 박테리아 CFU를 계수하는 것을 포함하는 정량적 방법을 설명합니다. 이 방법은 식물 뿌리에서 제거 된 집락화 된 균주를 계산할 수있는 희석 및 도금을 기반으로하며 뿌리의 총 집락화 된 박테리아 수를 계산할 수 있습니다 4,5.
먼저, A. thaliana 를 수경 재배 조건에서 배양 한 다음 박테리아 세포를 0.01 OD600의 최종 농도로 rhizosphere에 접종했습니다. 감염된 뿌리 조직을 접종 2일 후에 채취하고 멸균수로 세척하여 집락화되지 않은 박테리아 세포를 제거했습니다. 또한, 뿌리에 집락화된 박테리아 세포를 수집하여 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액에 희석하고, Luria-Bertani(LB) 한천 배지에 도약했습니다. 37°C에서 10시간 동안 배양한 후, LB 플레이트의 단일 콜로니를 계수하고 정규화하여 뿌리에 콜로니화된 박테리아 세포를 결정했습니다.
이 방법은 적용 가능성이 높고 반복성이 우수하며 정확한 rhizosphere 박테리아 집락화 측정에 더 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우수한 재현성을 달성하기 위해 이 프로토콜의 집락화 감지 프로세스를 위한 4가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 각 실험에서 접종된 박테리아 세포의 수가 정확히 동일한지 확인해야 합니다. 둘째, 멸균수로 집락화되지 않은 박테리아 세척 강도를 조절하는 것도 필요합니다. 셋째, 모든 시료 희석 공정은 미세 원심분리기 튜브에 가라앉기 쉬운 박테리아의 특성으로 인한 흡수 오류를 피하기 위…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(32370135), 중국 농업 과학원 혁신 프로그램(CAAS-CSAL-202302), 장쑤 농업 임업 직업 대학의 과학 기술 프로젝트(2021kj29)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
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