Summary

Mesure de la colonisation bactérienne sur les racines d’Arabidopsis thaliana dans des conditions hydroponiques

Published: March 01, 2024
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Summary

La colonisation des rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR) dans la rhizosphère est essentielle à son effet favorisant la croissance. Il est nécessaire d’uniformiser la méthode de détection de la colonisation de la rhizosphère bactérienne. Nous décrivons ici une méthode reproductible pour quantifier la colonisation bactérienne à la surface des racines.

Abstract

La mesure de la colonisation bactérienne sur la racine d’Arabidopsis thaliana est l’une des expériences les plus fréquentes dans les études d’interaction plante-microbe. Une méthode standardisée de mesure de la colonisation bactérienne dans la rhizosphère est nécessaire pour améliorer la reproductibilité. Nous avons d’abord cultivé des A. thaliana stériles dans des conditions hydroponiques, puis nous avons inoculé les cellules bactériennes dans la rhizosphère à une concentration finale deDO 600 de 0,01. 2 jours après l’inoculation, le tissu racinaire a été récolté et lavé trois fois dans de l’eau stérile pour éliminer les cellules bactériennes non colonisées. Les racines ont ensuite été pesées, et les cellules bactériennes colonisées sur la racine ont été collectées par vortex. La suspension cellulaire a été diluée en gradient avec un tampon salin tamponné au phosphate (PBS), suivie d’un placage sur un milieu gélosé Luria-Bertani (LB). Les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 10 h, puis les colonies individuelles sur les plaques LB ont été comptées et normalisées pour indiquer les cellules bactériennes colonisées sur les racines. Cette méthode est utilisée pour détecter la colonisation bactérienne dans la rhizosphère dans des conditions de mono-interaction, avec une bonne reproductibilité.

Introduction

Il existe des méthodes quantitatives et qualitatives pour détecter la colonisation de la rhizosphère par une seule souche bactérienne. Pour la méthode qualitative, il faut utiliser une souche qui exprime constitutivement la fluorescence, et la distribution et l’intensité de la fluorescence doivent être examinées à l’aide d’instruments de microscopie à fluorescence ou d’instruments confocaux laser 1,2. Ces stratégies peuvent bien refléter la colonisation bactérienne in situ3, mais elles ne sont pas aussi précises que les méthodes traditionnelles de comptage sur plaque en matière de quantification. De plus, en raison de la limitation de l’affichage de zones racinaires partielles au microscope, elle peut parfois être influencée par un biais subjectif.

Ici, nous décrivons une méthode quantitative, qui comprend la collecte des cellules bactériennes colonisées et le comptage des UFC bactériennes sur une plaque. Cette méthode est basée sur la dilution et le placage par lesquels les souches colonisées qui ont été retirées des racines des plantes peuvent être comptées, et le nombre total de bactéries colonisées sur la racine peut être calculé 4,5.

Tout d’abord, A. thaliana a été cultivé dans des conditions hydroponiques, puis des cellules bactériennes ont été inoculées dans la rhizosphère à une concentration finale de 0,01 OD600. Les tissus racinaires infectés ont été récoltés 2 jours après l’inoculation et lavés dans de l’eau stérile pour éliminer les cellules bactériennes non colonisées. De plus, les cellules bactériennes colonisées sur la racine ont été recueillies, diluées dans un tampon salin tamponné au phosphate (PBS) et plaquées sur un milieu gélosé Luria-Bertani (LB). Après une incubation à 37 °C pendant 10 h, des colonies individuelles sur des plaques LB ont été comptées et normalisées pour déterminer les cellules bactériennes colonisées sur les racines.

Cette méthode est très applicable, a une bonne répétabilité et est plus adaptée à la détermination précise de la colonisation bactérienne de la rhizosphère.

Protocol

1. Culture hydroponique stérile d’A. thaliana Préparez les plants d’A. thaliana .Préparez le milieu de culture des semis d’A. thaliana , qui se compose de 1/2 milieu MS (Murashige et Skoog) avec 2 % (poids/vol) de saccharose et 0,9 % (poids/volume) de gélose. Verser le milieu de stérilisation préparé dans des boîtes de Pétri carrées stériles (13 cm x 13 cm) avant la solidification. Évitez le séchage à l’air pou…

Representative Results

Pour tester la précision de la capacité de colonisation bactérienne détectée par cette méthode dans la rhizosphère d’A. thaliana, nous avons inoculé séparément Bacillus velezensis SQR9 WT et un mutant dérivé Δ8mcp dans la rhizosphère d’A . thaliana . Le Δ8mcp est un mutant qui n’a pas tous les gènes codant pour les chimiorécepteurs, et il a une colonisation significativement diminuée6. Nous avons mesuré leur colonisation 2 jours…

Discussion

Pour obtenir une bonne reproductibilité, il y a quatre étapes critiques pour le processus de détection de la colonisation de ce protocole. Tout d’abord, il est nécessaire de s’assurer que le nombre de cellules bactériennes inoculées est exactement le même dans chaque expérience. Deuxièmement, il est également nécessaire de contrôler l’intensité du nettoyage des bactéries non colonisées avec de l’eau stérile. Troisièmement, chaque processus de dilution d’échantillon doit être vortex avant d’…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32370135), le Programme d’innovation de l’Académie chinoise des sciences agricoles (CAAS-CSAL-202302), le Projet scientifique et technologique du Collège professionnel d’agriculture et de foresterie du Jiangsu (2021kj29).

Materials

6-well plate Corning 3516
Filter cell stainer Solarbio F8200-40µm
Microplate reader  Tecan Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium Hopebio HB8469-5
NaClO Alfa L14709
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Square petri dish Ruiai Zhengte PYM-130
Vortex Genie2 Scientific Industries G560E

References

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Cite This Article
Shu, X., Li, H., Wang, J., Wang, S., Liu, Y., Zhang, R. Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition. J. Vis. Exp. (205), e66241, doi:10.3791/66241 (2024).

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