Rearing Axenic Delia antiqua with Half-Fermented Sterile Diets (반 발효 멸균 식단으로 Axenic Delia antiqua 사육)
Summary
반 발효 멸균 사료로 axenic Delia antiqua 를 기르는 간단한 절차가 설명되어 있습니다. PCR을 사용하여 axnic D. antiqua 의 각 instar에서 하나의 Wolbachia 균주만 검출되었습니다.
Abstract
Axenic 곤충은 멸균 배지를 사용하는 멸균 인공 사육 시스템에서 얻습니다. 이 곤충은 작은 크기, 짧은 성장 주기 및 낮은 사료 요구 사항이 특징이며 미생물과 숙주 간의 관계를 연구하는 데 이상적입니다. 장내 미생물총은 곤충 숙주의 생리적 특성에 큰 영향을 미치며, 축삭 곤충에 특정 균주를 도입하면 장내 미생물 기능을 검증할 수 있습니다. Delia antiqua는 Diptera, Anthomyiidae 계통 및 Delia 속의 위협적인 해충으로 주로 양파, 마늘, 부추 및 Liliaceae 계통의 기타 채소를 먹습니다. 유충은 구근을 먹어 식물 전체가 썩고 시들고 심지어 죽기까지 합니다. 도끼 유충을 사육함으로써 장내 미생물이 D. antiqua의 성장과 발달에 미치는 영향을 관찰하기 위한 후속 연구를 수행할 수 있습니다. 관련 미생물의 항생제 제거와 관련된 방법과 달리 이 논문은 도끼 D. antiqua를 키우는 저비용 및 고효율 접근 방식을 제시합니다. D. antiqua 알의 표면 멸균 후, 유충을 기르기 위해 반발효 멸균 사료를 사용하였고, D. antiqua 의 액센 상태는 배양 의존적 및 배양 독립적 분석을 통해 검증하였다. 결론적으로, 곤충 알 살균과 유충 배양을 위한 멸균 식단 준비의 조합은 도끼 D. antiqua를 얻기 위한 효율적이고 간단한 방법의 개발을 가능하게 했습니다. 이 방법은 곤충-미생물 상호 작용을 연구하는 강력한 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
생존 가능한 미생물이나 기생충이 검출되지 않는 동물로 정의되는 Axenic 동물은 숙주-미생물 상호 작용을 연구하는 데 유용한 실험 모델입니다 1,2. 무척추동물의 가장 큰 그룹인 곤충은 미생물과 공생 관계를 형성할 수 있다3. 축삭 곤충은 공생 시스템에서 숙주-공생 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다4. 예를 들어, Nishide et al.5은 악취 웜 Plautia stali에 대한 실용적인 멸균 사육 절차를 확립하여 모델 공생 시스템에서 숙주-공생 상호 작용에 대한 신뢰할 수 있고 엄격한 분석을 가능하게 했습니다. 도끼 곤충은 알 단계를 살균하고 유충과 성충에게 멸균 식품을 제공함으로써 생산할 수 있다 6,7. Axenic 곤충은 매우 중요하며 생물학 연구에 널리 사용됩니다. 예를 들어, 서머빌(Somerville) 등8이 실시한 연구에 따르면 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae)를 접종한 다이아몬드백나방은 형질전환 수컷의 적응성을 향상시켰다.
Delia antiqua Meigen은 전 세계적으로 양파 및 기타 백합과 작물의 경제적으로 중요한 해충으로, 유충이 양파 및 기타 백합과 작물의 구근을 손상시킨다9. D. antiqua는 주로 온대 기후에서 발견되며 아메리카, 유럽 및 아시아의 양파 재배 지역에 널리 퍼져 있습니다. 적절하게 통제하지 않으면 양파(Allium cepa L.), 마늘(Allium sativum L.), 샬롯(Allium fistulosum L.) 및 부추(Alliumchoenoprasum L.)에서 50%에서 100%에 이르는 작물 손실을 유발할 수 있습니다10,11. 유충은 식물의 지하 부분을 먹으며, 이 먹이로 인해 묘목이 시들어 결국 죽습니다. 또한 손상된 식물은 병원균이 침입하여 구근을 썩게 할 수 있습니다12. 식물이 유충에 의해 완전히 소멸되지 않더라도 양파 식물이 초래하는 손상으로 인해 양파 식물은 시장성이 떨어지고 경제적 손실이 발생합니다.
곤충은 장내 미생물군과 밀접한 관련이 있으며, 대부분의 곤충 내장에는 숙주가 제공하는 영양분을 먹고 번성하는 다양한 공생 박테리아가 포함되어 있다13,14. Jing et al.15에 따르면 장내 공생 군집의 주요 기능은 필수 영양소를 제공하는 것이며, 소화 및 해독과 관련된 기능이 그 뒤를 잇습니다. 어떤 경우에는 장내 세균이 해충 관리 목적으로 미생물 자원 역할을 할 수 있습니다. 따라서 D. antiqua의 체내에서 개별 장내 세균의 성능과 특정 기능을 연구하는 것이 바람직합니다. 그러므로, 축삭 유충을 준비하는 것은 특정 박테리아 균주와 곤충 사이의 상호작용을 연구하는 데 특히 중요하다16. 현재, 곤충 장내 세균을 제거하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 관련 미생물을 박멸하기 위해 항생제 조합을 사용하는 것이다 17,18,19. 미생물 수만 줄일 수 있는 항생제만 사용하는 것과 달리, 곤충의 축류 사육은 미생물의 구성과 양을 제어할 수 있어 장내 미생물군의 기능을 보다 정확하게 검증할 수 있습니다.
따라서 이 기사에서는 axenic D. antiqua를 준비하고 기르기 위한 프로토콜을 소개합니다. Axenic 유충 먹이는 반 발효 식품과 결합 된 자연 식단의 고온 살균을 활용하여 얻습니다. 알은 액센 알을 얻기 위한 실험 프로토콜에 따라 멸균되고, 마지막으로 액센 알에서 액센 유충을 배양합니다. 액식 사육 시스템은 실험을 위해 한 세대 동안만 수행되었습니다. 이것은 곤충과 장내 미생물 사이의 상호 작용을 연구하는 데 편리함을 제공할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
곤충은 매우 복잡한 장내 미생물군(20,21)을 가지고 있으므로, 곤충-미생물 상호작용을 연구하기 위해 특정 장내 미생물 균주를 접종한 축곤충을 사용해야 합니다. 도끼 곤충의 준비는 이러한 연구 노력에 매우 중요합니다. 항생제 치료는 장내 미생물군을 제거하는 데 사용되는 방법입니다. 예를 들어, 융(Jung)과 킴(Kim)22은 스포도프?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국국가자연과학재단(32272530), 제남대학 신20대 정책(2021GXRC040), 산둥성 주요 과학기술혁신 프로젝트(2021TZXD002), 치루이공대학 과학교육통합사업(2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105)의 지원을 받았다.
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
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