Выращивание Axenic Delia antiqua с помощью полуферментированных стерильных рационов
Summary
Описана простая процедура выращивания аксенической Делии антиква с помощью полуферментированных стерильных рационов. С помощью ПЦР в каждом возрасте аксенической D. antiqua был обнаружен только один штамм Wolbachia.
Abstract
Аксенические насекомые получают из стерильных систем искусственного выращивания с использованием стерильных сред. Эти насекомые, отличающиеся небольшими размерами, коротким циклом роста и низкой потребностью в корме, идеально подходят для изучения взаимоотношений между микроорганизмами и хозяевами. Микробиота кишечника оказывает существенное влияние на физиологические характеристики насекомых-хозяев, и введение специфических штаммов аксеническим насекомым обеспечивает метод проверки микробных функций кишечника. Delia antiqua, опасный вредитель отряда Diptera, семейства Anthomyiidae и рода Delia, в основном питается луком, чесноком, луком-пореем и другими овощами семейства Лилейные. Его личинки питаются луковицами, вызывая гниение, увядание и даже гибель целых растений. При выращивании личинок аксенических растений можно проводить последующие исследования для наблюдения за влиянием кишечной микрофлоры на рост и развитие D. antiqua. В отличие от метода, предполагающего уничтожение антибиотиками ассоциированных микробов, в данной статье представлен малозатратный и высокоэффективный подход к выращиванию аксенической D. antiqua. После поверхностной стерилизации яиц D. antiqua для выращивания личинок использовали полуферментированные стерильные диеты, а аксеническое состояние D. antiqua проверяли с помощью культурально-зависимых и культурно-независимых анализов. В заключение следует отметить, что сочетание стерилизации яиц насекомых и приготовления стерильных рационов для культивирования личинок позволило разработать эффективный и простой метод получения аксенической D. antiqua. Этот метод обеспечивает мощный подход к изучению взаимодействия насекомых и микрофлоры.
Introduction
Аксенические животные, определяемые как животные, у которых не могут быть обнаружены жизнеспособные микроорганизмы или паразиты, являются ценными экспериментальными моделями для изучения взаимодействий между хозяином и микроорганизмом 1,2. Насекомые, самая многочисленная группа беспозвоночных, могут образовывать симбиотические отношения с микроорганизмами3. Аксенические насекомые могут быть использованы для изучения взаимодействий между хозяином и симбионтом в симбиотических системах4. Например, Nishide et al.5 разработали практическую стерильную процедуру выращивания червя Plautia stali с дурным запахом, позволяющую проводить надежный и строгий анализ взаимодействий между хозяином и симбионтом в модельных симбиотических системах. Аксенические насекомые могут быть получены путем стерилизации стадии яйца и обеспечения стерильной пищей личинок и взрослых особей 6,7. Аксенические насекомые имеют большое значение и широко используются в биологических исследованиях. Например, исследование, проведенное Somerville et al.8, показало, что бабочки, инокулированные Enterobacter cloacae, улучшают приспособляемость трансгенных самцов.
Delia antiqua Meigen является экономически важным вредителем лука и других культур семейства Liliaceae во всем мире, его личинки повреждают луковицы лука и других культур семейства Liliaceae9. D. antiqua в основном встречается в умеренном климате и широко распространен в районах выращивания лука в Северной и Южной Америке, Европе и Азии. При отсутствии надлежащего контроля он может привести к потерям урожая лука (Allium cepa L.), чеснока (Allium sativum L.), лука-шалота (Allium fistulosum L.) и лука-порея (Alliumchoenoprasum L.) в диапазоне от 50% до 100%10,11. Личинки питаются подземными частями растений, и эта подкормка вызывает увядание и в конечном итоге гибель рассады. Кроме того, поврежденные растения могут позволить болезнетворным микроорганизмам проникнуть внутрь, что приведет к загниванию луковиц12. Даже если растения не полностью съедены личинками, ущерб, который они наносят, делает растения лука нетоварным и приводит к экономическим потерям.
Насекомые тесно связаны с микробиотой кишечника, и большинство кишечника насекомых содержат различные симбиотические бактерии, которые процветают за счет питательных веществ, поставляемых хозяином13,14. Jing et al.15 показали, что основной функцией кишечного симбиотического сообщества является обеспечение необходимыми питательными веществами, за которыми следуют функции, связанные с пищеварением и детоксикацией. В некоторых случаях кишечные бактерии могут служить микробным ресурсом для борьбы с вредителями. Следовательно, желательно изучение характеристик и специфических функций отдельных кишечных бактерий в организме D. antiqua. Поэтому подготовка личинок аксенических особо важна для изучения взаимодействий между конкретными штаммами бактерий и насекомыми16. В настоящее время широко используемым методом уничтожения кишечных бактерий насекомых является использование комбинации антибиотиков для уничтожения ассоциированных микробов 17,18,19. В отличие от использования только антибиотиков, которые могут только уменьшить количество микробов, аксеническое выращивание насекомых позволяет контролировать состав и количество микроорганизмов, что позволяет более точно проверять функциональность микробиоты кишечника.
Таким образом, в данной статье представлен протокол подготовки и выращивания аксенического D. antiqua. Корм для личинок аксенических получают путем высокотемпературной стерилизации натуральных рационов в сочетании с полуферментированными продуктами. Яйца стерилизуют в соответствии с экспериментальным протоколом для получения аксенических яиц, и, наконец, из аксенических яиц культивируют личинок аксена. Для эксперимента аксеническая система выращивания проводилась только для одного поколения. Это обеспечит удобство для изучения взаимодействия насекомых и микробиоты кишечника.
Protocol
Representative Results
Discussion
Насекомые обладают очень сложной микробиотой кишечника20,21, что обуславливает необходимость использования аксенических насекомых, инокулированных специфическими штаммами кишечной микрофлоры, для изучения взаимодействия насекомых и микроорганизмов. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32272530), проектом «Новые двадцать стратегий для университетов в Цзинане» (2021GXRC040), крупными проектами научно-технических инноваций в провинции Шаньдун (2021TZXD002) и Проектом интеграции науки и образования Технологического университета Цилу (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
References
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
