Cría de Delia antiqua axénica con dietas estériles semifermentadas
Summary
Se describe un procedimiento sencillo para la cría de Delia antiqua axénica con dietas estériles semifermentadas. Solo se detectó una cepa de Wolbachia en cada estadio de D. antiqua axénica mediante PCR.
Abstract
Los insectos axénicos se obtienen a partir de sistemas de cría artificial estériles utilizando medios estériles. Estos insectos, caracterizados por su pequeño tamaño, ciclo de crecimiento corto y bajos requerimientos de alimento, son ideales para estudiar la relación entre microorganismos y hospedadores. La microbiota intestinal influye significativamente en las características fisiológicas de los insectos huéspedes, y la introducción de cepas específicas en los insectos axénicos proporciona un método para verificar las funciones microbianas intestinales. Delia antiqua, una plaga amenazante del orden Diptera, la familia Anthomyiidae y el género Delia, se alimenta principalmente de cebollas, ajos, puerros y otras verduras de la familia Liliaceae. Sus larvas se alimentan de los bulbos, causando la pudrición, el marchitamiento e incluso la muerte de plantas enteras. Al criar larvas axénicas, se pueden realizar estudios de seguimiento para observar los efectos de la microflora intestinal en el crecimiento y desarrollo de D. antiqua. A diferencia del método que implica la eliminación de antibióticos de los microbios asociados, este artículo presenta un enfoque de bajo costo y alta eficiencia para la cría de D. antiqua axénica. Después de la esterilización superficial de los huevos de D. antiqua , se utilizaron dietas estériles semifermentadas para criar larvas, y el estado axénico de D. antiqua se verificó mediante ensayos dependientes e independientes del cultivo. En conclusión, la combinación de la esterilización de huevos de insectos y la preparación de dietas estériles para el cultivo de larvas ha permitido el desarrollo de un método eficiente y sencillo para la obtención de D. antiqua axénica. Este método proporciona un enfoque poderoso para estudiar las interacciones entre insectos y microflora.
Introduction
Los animales axénicos, definidos como animales en los que no se pueden detectar microorganismos o parásitos viables, son modelos experimentales valiosos para estudiar las interacciones huésped-microorganismo 1,2. Los insectos, el grupo más grande de invertebrados, pueden formar relaciones simbióticas con los microorganismos3. Los insectos axénicos se pueden utilizar para estudiar las interacciones huésped-simbionte en sistemas simbióticos4. Por ejemplo, Nishide et al.5 establecieron un procedimiento práctico de cría estéril para el gusano de mal olor Plautia stali, que permite un análisis fiable y riguroso de las interacciones huésped-simbionte en sistemas simbióticos modelo. Los insectos axénicos pueden producirse esterilizando la etapa de huevo y proporcionando alimento estéril a las larvas y adultos 6,7. Los insectos axénicos son de gran importancia y se utilizan ampliamente en la investigación biológica. Por ejemplo, un estudio realizado por Somerville et al.8 demostró que las polillas dorso de diamante inoculadas con Enterobacter cloacae mejoraron la adaptabilidad de los machos transgénicos.
Delia antiqua Meigen es una plaga económicamente importante de las cebollas y otros cultivos de Liliaceae en todo el mundo, ya que sus larvas dañan los bulbos de las cebollas y otros cultivos de Liliaceae9. D. antiqua se encuentra principalmente en climas templados y está muy extendida en las zonas de cultivo de cebollas de América, Europa y Asia. Si no se controla adecuadamente, puede causar pérdidas en la cosecha de cebolla (Allium cepa L.), ajo (Allium sativum L.), chalotes (Allium fistulosum L.) y puerros (Alliumchoenoprasum L.) que oscilan entre el 50% y el 100%10,11. Las larvas se alimentan de las partes subterráneas de las plantas, y esta alimentación hace que las plántulas se marchiten y finalmente mueran. Además, las plantas dañadas pueden permitir la entrada de patógenos, lo que provoca la pudrición de los bulbos12. Incluso si las plantas no son consumidas completamente por las larvas, el daño que causan hace que las plantas de cebolla no sean comercializables y resultan en pérdidas económicas.
Los insectos están estrechamente asociados con la microbiota intestinal, y la mayoría de los intestinos de los insectos contienen una variedad de bacterias simbióticas que prosperan con los nutrientes proporcionados por el huésped13,14. Jing et al.15 demostraron que la función principal de la comunidad simbiótica intestinal es proporcionar nutrientes esenciales, seguida de funciones relacionadas con la digestión y la desintoxicación. En ciertos casos, las bacterias intestinales pueden servir como un recurso microbiano para el control de plagas. En consecuencia, es deseable estudiar el rendimiento y las funciones específicas de las bacterias intestinales individuales dentro del cuerpo de D. antiqua. Por lo tanto, la preparación de larvas axénicas es particularmente importante para estudiar las interacciones entre cepas bacterianas específicas e insectos16. Actualmente, un método comúnmente utilizado para eliminar las bacterias intestinales de los insectos es el uso de una combinación de antibióticos para erradicar los microbios asociados 17,18,19. A diferencia del uso de antibióticos solos, que solo pueden reducir el número microbiano, la cría axénica de insectos permite controlar la composición y la cantidad de microorganismos, lo que permite una validación más precisa de la funcionalidad de la microbiota intestinal.
Por lo tanto, este artículo presenta un protocolo para la preparación y cría de D. antiqua axénica. El alimento para larvas axénicas se obtiene mediante la esterilización a alta temperatura de dietas naturales combinadas con alimentos semifermentados. Los huevos se esterilizan siguiendo un protocolo experimental para obtener huevos axénicos y, finalmente, se cultivan larvas axénicas a partir de los huevos axénicos. El sistema de cría axénica se llevó a cabo durante una sola generación para el experimento. Esto facilitará el estudio de la interacción entre los insectos y la microbiota intestinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los insectos poseen una microbiota intestinal muy compleja20,21, lo que hace necesario el uso de insectos axénicos inoculados con cepas microbianas intestinales específicas para estudiar las interacciones insecto-microorganismo. La preparación de insectos axénicos es crucial para este tipo de esfuerzos de investigación. El tratamiento con antibióticos es un método utilizado para eliminar la microbiota intestinal. Por ejemplo, Jung y Kim, de<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32272530), el Proyecto de Nuevas Veinte Políticas para la Universidad de Jinan (2021GXRC040), los Grandes Proyectos de Innovación Científica y Tecnológica en la Provincia de Shandong (2021TZXD002) y el Proyecto de Integración de la Ciencia y la Educación de la Universidad Tecnológica de Qilu (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
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