Uppfödning av axenic Delia antiqua med halvfermenterade sterila dieter
Summary
En enkel procedur för uppfödning av axenisk Delia antiqua med halvfermenterade sterila dieter beskrivs. Endast en Wolbachia-stam detekterades i varje stjärna av axenisk D. antiqua med hjälp av PCR.
Abstract
Axeninsekter erhålls från sterila artificiella uppfödningssystem med sterila medier. Dessa insekter, som kännetecknas av sin lilla storlek, korta tillväxtcykel och låga foderbehov, är idealiska för att studera förhållandet mellan mikroorganismer och värdar. Tarmmikrobiotan påverkar i hög grad de fysiologiska egenskaperna hos insektsvärdar, och att introducera specifika stammar i axeninsekter ger en metod för att verifiera tarmmikrobiella funktioner. Delia antiqua, en hotfull skadegörare i ordningen Diptera, familjen Anthomyiidae och släktet Delia, livnär sig främst på lök, vitlök, purjolök och andra grönsaker av familjen Liliaceae. Dess larver livnär sig på lökarna och orsakar ruttnande, vissnande och till och med död av hela växter. Genom att föda upp axenlarver kan uppföljande studier genomföras för att observera effekterna av tarmmikrofloran på tillväxt och utveckling av D. antiqua. Till skillnad från metoden som involverar antibiotikaeliminering av associerade mikrober, presenterar denna artikel en billig och högeffektiv metod för att höja axenic D. antiqua. Efter ytsterilisering av D. antiqua-ägg användes halvfermenterade sterila dieter för att föda upp larver, och det axeniska tillståndet hos D. antiqua verifierades genom odlingsberoende och odlingsoberoende analyser. Sammanfattningsvis har kombinationen av sterilisering av insektsägg och beredning av steril föda för larvodling möjliggjort utvecklingen av en effektiv och enkel metod för att erhålla axenisk D. antiqua. Denna metod ger ett kraftfullt tillvägagångssätt för att studera interaktioner mellan insekter och mikroflora.
Introduction
Axeniska djur, definierade som djur där inga livsdugliga mikroorganismer eller parasiter kan detekteras, är värdefulla experimentella modeller för att studera värd-mikroorganisminteraktioner 1,2. Insekter, den största gruppen ryggradslösa djur, kan bilda symbios med mikroorganismer3. Axeniska insekter kan användas för att studera värd-symbiontinteraktioner i symbiotiska system4. Till exempel etablerade Nishide et al.5 en praktisk steril uppfödningsprocedur för illaluktande mask Plautia stali, vilket möjliggör tillförlitlig och rigorös analys av värd-symbiontinteraktioner i modellsymbiotiska system. Axeninsekter kan framställas genom att sterilisera äggstadiet och ge steril föda till larverna och de vuxna 6,7. Axeninsekter har stor betydelse och används flitigt inom biologisk forskning. Till exempel visade en studie utförd av Somerville et al.8 att diamantfjärilar som inokulerats med Enterobacter cloacae förbättrade anpassningsförmågan hos transgena hanar.
Delia antiqua Meigen är en ekonomiskt viktig skadegörare på lök och andra Liliaceae-grödor över hela världen, med sina larver som skadar lökarna på lök och andra Liliaceae-grödor9. D. antiqua finns främst i tempererade klimat och är utbredd i lökodlingsområden i Amerika, Europa och Asien. Om den inte kontrolleras på rätt sätt kan den orsaka skördeförluster i lök (Allium cepa L.), vitlök (Allium sativum L.), schalottenlök (Allium fistulosum L.) och purjolök (Alliumchoenoprasum L.) på mellan 50 % och 100 %10,11. Larverna livnär sig på de underjordiska delarna av växterna, och denna utfodring gör att plantorna vissnar och så småningom dör. Dessutom kan skadade växter tillåta patogener att komma in, vilket leder till lökröta12. Även om växterna inte äts upp helt av larverna, gör skadorna de orsakar lökplantorna osäljbara och resulterar i ekonomiska förluster.
Insekter är nära förknippade med tarmmikrobiota, och de flesta insekttarmar innehåller en mängd olika symbiotiska bakterier som trivs på de näringsämnen som värden ger13,14. Jing et al.15 visade att den primära funktionen hos tarmens symbiotiska samhälle är att tillhandahålla viktiga näringsämnen, följt av funktioner relaterade till matsmältning och avgiftning. I vissa fall kan tarmbakterier fungera som en mikrobiell resurs för skadedjursbekämpning. Därför är det önskvärt att studera de enskilda tarmbakteriernas prestationer och specifika funktioner i kroppen av D. antiqua. Därför är det särskilt viktigt att förbereda axenlarver för att studera samspelet mellan specifika bakteriestammar och insekter16. För närvarande är en vanlig metod för att eliminera insektstarmbakterier användningen av en antibiotikakombination för att utrota associerade mikrober 17,18,19. Till skillnad från att enbart använda antibiotika, som bara kan minska antalet mikrobiella ämnen, möjliggör axenuppfödning av insekter kontroll över sammansättningen och mängden mikroorganismer, vilket möjliggör en mer exakt validering av tarmmikrobiotans funktionalitet.
I denna artikel introduceras därför ett protokoll för beredning och uppfödning av axenic D. antiqua. Axenic larvfoder erhålls genom att använda högtemperatursterilisering av naturliga dieter i kombination med halvfermenterade livsmedel. Äggen steriliseras enligt ett experimentellt protokoll för att erhålla axeniska ägg, och slutligen odlas axenlarver från axenäggen. Axenuppfödningssystemet genomfördes endast under en generation för försöket. Detta kommer att göra det lättare att studera interaktionen mellan insekter och tarmmikrobiota.
Protocol
Representative Results
Discussion
Insekter har en mycket komplex tarmmikrobiota20,21, vilket gör det nödvändigt att använda axeninsekter som inokulerats med specifika tarmmikrobiella stammar för att studera interaktioner mellan insekter och mikroorganismer. Beredningen av axeninsekter är avgörande för sådana forskningsinsatser. Antibiotikabehandling är en metod som används för att eliminera tarmmikrobiota. Till exempel matade Jung och Kim22 Spodoptera exigu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (32272530), New Twenty Policies for University in Jinan Project (2021GXRC040), Major Scientific and Technological Innovation Projects in Shandong-provinsen (2021TZXD002) och Science and Education Integration Project vid Qilu University of Technology (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
References
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
