기계적 스트레스 하에서의 세포 거동에 대한 탐구는 세포 역학 및 기계생물학의 발전에 중추적인 역할을 합니다. 당사는 단일 세포에서 세포 내 신호의 포괄적인 분석과 제어된 기계적 자극을 결합하는 새로운 방법인 형광 마이크로피펫 흡인(fMPA) 기법을 소개합니다. 이 기술은 살아있는 세포 기계생물학에 대한 새로운 심층 연구를 조사합니다.
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이 논문에서
요약
초록
마이크로피펫 흡인 분석은 오랫동안 살아있는 세포 역학 연구의 초석이 되어 왔으며, 기계적 스트레스에 대한 세포 반응에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 백서는 형광 결합 마이크로피펫 흡인(fMPA) 분석의 혁신적인 적응에 대해 자세히 설명합니다. fMPA 분석은 이온 채널에 의해 매개되는 살아있는 세포 기계적 전달 과정을 동시에 모니터링하면서 정밀한 기계적 힘을 투여할 수 있는 기능을 도입합니다. 정교한 설정에는 정밀하게 설계된 붕규산 유리 마이크로피펫이 미세하게 조절되는 물 저장조와 공압 흡입 시스템에 연결되어 있어 ± 1mmHg까지 정제된 증분으로 제어된 압력 적용이 용이합니다. 중요한 개선 사항은 epi-fluorescence 이미징의 통합으로, 흡인 중 세포 형태학적 변화와 세포 내 칼슘 플럭스를 동시에 관찰하고 정량화할 수 있습니다. fMPA 분석은 epi-fluorescence 이미징과 마이크로피펫 흡인의 시너지 효과를 통해 기계적으로 까다로운 환경에서 세포 메카노센싱 연구를 위한 새로운 표준을 제시합니다. 이 다면적 접근 방식은 다양한 실험 설정에 적용할 수 있어 단일 세포 메카노센싱 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.
서론
세포 행동의 세계에서 펼쳐지는 발견은 접착, 이동 및 분화와 같은 동적 세포 활동을 지시하는 데 있어 장력, 유체 전단 응력, 압축 및 기판 강성과 같은 기계적 자극의 역할을 강조했습니다. 이러한 기계생물학적 측면은 세포가 생리적 환경과 상호 작용하고 반응하여 다양한 생물학적 과정에 영향을 미치는 방식을 설명하는 데 가장 중요합니다 1,2.
지난 10년 동안 마이크로피펫 기반 흡인 분석은 기계적 자극에 대한 다양한 세포 반응을 연구하는 다목적 도구로 두각을 나타냈습니다. 이 기술은 세포 탄성 계수, 강성 및 피질 장력을 포함하여 단일 세포 수준에서 살아있는 세포의 고유한 기계적 특성에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 이러한 분석을 통해 세포막 장력, 세포막에 가해지는 압력 및 피질 장력과 같은 다양한 기계적 매개변수를 측정할 수 있습니다(표 1에 요약됨). 열망하는 힘을 연구하는 것은 특히 단편화, 신장 및 발아를 포함한 막 역학 영역에서 세포 기능과 과정에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 우리의 이해를 풍부하게 했습니다 3,4
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프로토콜
이 프로토콜은 시드니 대학교의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따르며 승인을 받았습니다. 이 연구를 위해 기증자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.
1. 인간 적혈구 분리
참고: 1.1단계는 Institutional Review Board에서 승인한 프로토콜을 사용하여 훈련된 정맥 전문의가 수행해야 합니다.
- 19G 나비 바늘을 사용하여 정중 입방 정맥에서 5mL의 혈액을 채취합니다.
- 채취한 혈액을 1:200 에녹사파린이 들어 있는 15mL 튜브에 넣어 응고를 방지합니다.
- 에녹사파린 항응고 혈액 5μL를 탄산염/중탄산염 완충액 1mL에 희석합니다(C-완충액, pH = 8.5-9; 재료 목차).
- 희석된 혈액 샘플을 900× g 에서 1분 동안 원심분리하여 적혈구를 침전시킵니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 디캔팅합니다.
- 1mL의 C-완충액(재료 표)으로 RBC 펠릿을 2회 세척하고 매번 900× g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 그 후, 동일한 원심분리....
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결과
마이크로피펫 흡인 분석을 확립하기 위해 먼저 손잡이로 연결된 두 개의 금속 사각형(구리/알루미늄)으로 구성된 맞춤형 셀 챔버를 구성했습니다. 두 개의 3차 절단 유리 커버슬립(40mm × 7mm × 0.17mm)을 부착하여 Tyrode의 완충액에 부유하는 200μL의 적혈구로 채워진 챔버를 만들었습니다. 적혈구를 챔버에 도입한 후 맞춤형 붕규산 마이크로피펫을 홀더에 고정하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 챔버 내에 조심스럽게 배치했습니다. 이어서, 마이크로피펫을 더 가까이 가져와 표적 적혈구를 포획하였다.
세포 흡인의 경우, 이 방법은 공압식 고속 압력 클램프를 사용하여 음의 흡인 압력을 미세 조정했습니다. 그런 다음 형광 이미징을 수행하여 적용된 다양한 음의 흡인 압력에서 칼슘 동원을 조사했습니다.
fMPA를 사용하여 적혈구가 다양한 음압 흡인압에 어떻게 반응하는지 조사한 결과, 적용된 음압과 흡인된 적혈구에 존재하는 칼슘 유.......
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토론
마이크로피펫 흡인 분석은 세포 생체 역학의 심오한 복잡성을 조사하기 위해 상당한 압력 조절, 정확한 공간 오케스트레이션 및 신뢰할 수 있는 시간적 식별을 배치하는 정교한 방법론을 구현합니다. 이 연구는 다양한 자극 하에서 적혈구가 나타내는 미묘한 기계적 민감성 반응을 밝히기 위한 중요한 도구로서 fMPA의 적용에 특히 중점을 둡니다. 명시야 신호와 형광 신호를 동시에 사용하면 세포 현상을 다각적으로 탐구할 수 있어 세포 내 칼슘 유입을 실시간으로 모니터링하고 검출할 수 있습니다. 이 접근법은 적혈구의 복잡한 기계 감지 반응에 대한 통합적인 통찰력을 제공합니다.
중요한 것은, fMPA 기법의 적용 가능성은 혈소판 및 뉴런과 같이 높은 기계적 민감도를 적용하지 않는 다른 세포 유형에도 사용될 수 있기 때문에 적혈구를 넘어 확장된다는 점이다9. 또한 fMPA는 실험 처리 중 세포 무결성에 미치는 영향을 최소화하기 때문에 세포의 자연 상태 보존.......
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공개 사항
저자들은 본 연구와 관련하여 보고할 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
추가 기증자 모집, 혈액 수집 및 정맥 절개술 지원에 대해 Nurul Aisha Zainal Abidin과 Laura Moldovan에게 감사드립니다. 장비와 시약을 정리해 주신 Tomas Anderson과 Arian Nasser에게 감사드립니다. 이 연구는 호주 연구 위원회(ARC) 디스커버리 프로젝트(DP200101970-L. A.J.); 호주 국립 보건 및 의료 연구 위원회(NHMRC) 아이디어 보조금(APP2003904-L. A.J.); NHMRC 장비 보조금-LAJ; NSW 심혈관 역량 강화 프로그램(초중기 경력 연구원 보조금-LAJ); NSW CVRN-VCCRI 연구 혁신 보조금; 글로벌 및 연구 참여 사무국(시드니-글래스고 파트너십 협력상-LAJ); L.A.J.는 National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2(105863)이자 Snow Medical Research Foundation Fellow(2022SF176)입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| &마이크로; Manager | Micro-Manager | 버전 2.0.0 | |
| 1mL 주사기 | Terumo | 210320D | 는 Microfil |
| 200 &마이크로; L 피펫 | 에펜도르프 | 3123000055 | 레드 클루드 셀 준비 |
| 22 x 40 mm 커버 슬립 | 니트텔 유리 | MS0014 | 셀 챔버 어셈블리 |
| 50 mL 주사기 | Terumo | 220617E | 급수탑에 연결 |
| 칼슘 클로라이드 (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's 완충제 준비 - 12 mM NaHCO3, 10 mM Hepes, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, 그리고 1 mM CaCl<>sub2로 보충된 5.5 mM D-포도당. 최종 pH = 7.2 |
| 원심분리기 5425 | Eppendorf | 5405000280 | 레드 클루드 세포 제제 |
| Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | 수집된 혈액의 응고를 방지합니다. 10,000 U/mL |
| DAQami | 부지런한 | ||
| 형광 광원 | CoolLED | pE-300 | 마이크로피펫 흡인 하드웨어 시스템 |
| 유리 모세관 | Narishige | G-1 | 마이크로피펫 제조 |
| 포도 | Sigma-Aldrich | G8270 | Tryode의 완충액 준비 - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl 및 5.5 mM D-포도당에 1 mM CaCl2이 보충됨. 최종 pH = 7.2 |
| Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode의 완충액 준비 - 12mM NaHCO3, 10mM Hepes, 0.137M NaCl, 2.7mM KCl 및 5.5mM D-포도당에 1mM CaCl<>sub2이 보충됨. 최종 pH = 7.2 |
| 고속 GigE 카메라 | Manta | G-040B | 마이크로피펫 흡인 하드웨어 시스템 |
| 고속 압력 클램프 | 과학 기기 | HSPC-2-SB | 압력 펌프와 협력 |
| 고속 압력 클램프 헤드 스테이지 | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | 는 압력 펌프 |
| Imaris | Oxford Instruments | ||
| Inverted Microscopy | 올림푸스 | Olympus IX83 | 마이크로피펫 흡인 하드웨어 시스템 |
| Microfil | 세계 정밀 기기 | MF34G-5 | 34 G (67 mm Long) 컷 마이크로피펫에 Revome 공기 방울을 넣고 피펫 팁의 개구부를 테스트합니다. |
| 마이크로피펫 풀러 | 셔터 기기 | P1000 | 마이크로피펫 제조 |
| Milli Q EQ 7000 초순수 정화 시스템 | Merck Millipore | ZEQ7000T0C | 탄산염/중탄산염 완충액 및 Tryode의 완충제 |
| 피펫 마이크로포지 | Narishige | MF-900 | 마이크로피펫 제조 |
| 염화칼륨 (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's; 완충제 - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, 및 5.5 mM D-포도당에 1 mM CaCl2이 보충되었습니다. 최종 pH = 7.2 |
| 압력 펌프 | 과학 기기 | PV-PUMP | 실험 중 제어 압력 유도 |
| Prime 95B 카메라 | Photometrics | Prime 95B sCMOS | Flourscent 이미징 |
| 로터리 휠 원격 장치 | 센스 에이펙스 | 마이크로피펫 위치 조정을 위한 | uM-RM3 |
| Scepter 3.0 휴대용 세포 계수기 | Merck Millipore | PHCC340KIT | 자동 세포 계수기 |
| 중탄산나트륨(NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | 탄산염/중탄산염 완충액 준비 - 250mL의 Mili Q 물 중 Na<>2><CO3 2.65g - 최종 pH = 8-9. |
| 탄산나트륨 (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | 탄산염/중탄산염 완충액 준비 - 250 mL의 Mili Q 물 2.1 g에 NaHCO3 2.65 g과 Na2CO3 - 최종 pH = 8-9. |
| 염화나트륨(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tryode의 완충액 준비 - 12mM NaHCO3, 10mM Hepes, 0.137M NaCl, 2.7mM KCl 및 5.5mM D-포도당에 1mM CaCl2이 보충되었습니다. 최종 pH = 7.2 |
| 인산나트륨 일염기 일수화물(NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's; 완충액 준비 - 12 mM NaHCO3, 10 mM Hepes, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl 및 5.5 mM D-포도당에 1 mM CaCl2이 보충됨. 최종 pH = 7.2 |
| 터치 스크린 제어 장치 | 센스 에이펙스 | 마이크로피펫 위치 조정을 위한 | uM-TSC |
| X 드라이 목표 | 올림푸스 | Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL | 마이크로피펫 흡인 하드웨어 시스템 |
참고문헌
- González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
- Mierke, C. T.
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재인쇄 및 허가
