Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Shaileshanand Jha; Sucharita Bose; Kutti R. Vinothkumar

doi:10.3791/66310

JoVE Journal > Biochemistry

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생화학

इलेक्ट्रॉन क्रायोमाइक्रोस्कोपी से प्राप्त मानचित्रों में लिगैंड मॉडलिंग

Published: July 19, 2024

doi:

10.3791/66310

Shaileshanand Jha*¹, Sucharita Bose*², Kutti R. Vinothkumar

¹National Centre for Biological Sciences,Tata Institute of Fundamental Research, ²Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल मैक्रोमोलेक्यूल्स के क्रायोईएम मानचित्रों में छोटे-अणु लिगेंड मॉडलिंग के लिए उपलब्ध उपकरणों का परिचय देता है।

Abstract

आणविक तंत्र, अंतर्निहित जैविक प्रक्रियाओं और दवा विकास को समझने के लिए एक मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स में प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन को समझना महत्वपूर्ण है। हाल के वर्षों में, क्रायोजेनिक नमूना इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) मैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचनाओं को निर्धारित करने और निकट-परमाणु संकल्प पर लिगैंड बाध्यकारी के मोड की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरा है। क्रायोईएम मानचित्रों में गैर-प्रोटीन अणुओं की पहचान और मॉडलिंग अक्सर डेटा में ब्याज के अणु और अंतर्निहित शोर में अनिसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन के कारण चुनौतीपूर्ण होती है। इस लेख में, पाठकों को वर्तमान में चयनित मैक्रोमोलेक्यूल्स का उपयोग करके लिगैंड पहचान, मॉडल निर्माण और परमाणु निर्देशांक के शोधन के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न सॉफ्टवेयर और विधियों से परिचित कराया जाता है। एक लिगैंड की उपस्थिति की पहचान करने के सबसे सरल तरीकों में से एक, जैसा कि एनोलेज़ एंजाइम के साथ दिखाया गया है, लिगैंड के साथ और बिना प्राप्त दो मानचित्रों को घटाना है। लिगैंड का अतिरिक्त घनत्व उच्च सीमा पर भी अंतर मानचित्र में बाहर खड़े होने की संभावना है। ऐसे उदाहरण हैं, जैसा कि मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर एमजीएलयू₅ के मामले में दिखाया गया है, जब इस तरह के सरल अंतर नक्शे उत्पन्न नहीं किए जा सकते हैं। Fo-Fc ओमिट मैप प्राप्त करने की हाल ही में शुरू की गई विधि लिगैंड की उपस्थिति को मान्य और प्रदर्शित करने के लिए एक उपकरण के रूप में काम कर सकती है। अंत में, एक उदाहरण के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन किए गए β-गैलेक्टोसिडेज़ का उपयोग करते हुए, क्रायोईएम मानचित्रों में लिगैंड और विलायक अणुओं के मॉडलिंग पर संकल्प के प्रभाव का विश्लेषण किया जाता है, और दवा की खोज में क्रायोईएम का उपयोग कैसे किया जा सकता है, इस पर एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया जाता है।

Introduction

कोशिकाएं एक साथ और स्वतंत्र रूप से असंख्य रासायनिक प्रतिक्रियाओं को पूरा करके अपने कार्यों को पूरा करती हैं, प्रत्येक पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में अपने अस्तित्व और अनुकूलन क्षमता को सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक विनियमित होती हैं। यह आणविक मान्यता द्वारा प्राप्त किया जाता है, जो बायोमोलेक्यूल्स, विशेष रूप से प्रोटीन को अन्य मैक्रोमोलेक्यूल्स के साथ-साथ छोटे अणुओं या लिगेंड¹ के साथ क्षणिक या स्थिर परिसरों को बनाने में सक्षम बनाता है। इस प्रकार, प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन जीव विज्ञान में सभी प्रक्रियाओं के लिए मौलिक हैं, जिसमें प्रोटीन अभिव्यक्ति और गतिविधि का विनियमन, एंजाइमों द्वारा सब्सट्रेट और कॉफ़ैक्टर्स की मान्यता शामिल है, साथ ही साथ कोशिकाएं^कैसे ^1,2 संकेतों को समझती हैं और रिले करती हैं। प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स के गतिज, थर्मोडायनामिक और संरचनात्मक गुणों की बेहतर समझ से लिगैंड इंटरैक्शन के आणविक आधार का पता चलता है और दवा बातचीत और विशिष्टता को अनुकूलित करके तर्कसंगत दवा डिजाइन की सुविधा भी मिलती है। प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक किफायती और तेज़ दृष्टिकोण आणविक डॉकिंग का उपयोग करना है, जो एक कम्प्यूटेशनल विधि है जो वस्तुतः छोटे अणुओं की एक विविध श्रेणी को स्क्रीन करती है और प्रोटीन³ को लक्षित करने के लिए इन लिगेंड के बाध्यकारी मोड और आत्मीयता की भविष्यवाणी करती है। हालांकि, एक्स-रे विवर्तन (एक्सआरडी), परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), या इलेक्ट्रॉन क्रायोमाइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) द्वारा निर्धारित उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं से प्रयोगात्मक साक्ष्य इस तरह की भविष्यवाणियों के लिए आवश्यक प्रमाण प्रदान करते हैं और किसी दिए गए लक्ष्य के लिए नए और अधिक प्रभावी सक्रियकर्ताओं या अवरोधकों के विकास में सहायता करते हैं। यह लेख संक्षिप्त नाम ‘क्रायोईएम’ का उपयोग करता है क्योंकि तकनीक को आमतौर पर संदर्भित किया जाता है। हालांकि, सही नामकरण चुनने पर एक बहस चल रही है, और हाल ही में, क्रायोजेनिक-सैंपल ईलेक्ट्रॉन एमइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) शब्द को यह इंगित करने के लिए प्रस्तावित किया गया है कि नमूना क्रायोजेनिक तापमान पर है और इलेक्ट्रॉनों के साथ इमेज किया गया है⁴. इसी तरह, क्रायोईएम से प्राप्त मानचित्रों को इलेक्ट्रॉन क्षमता, इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षमता, या कूलम्ब क्षमता कहा गया है, और सादगी के लिए, यहां हम क्रायोईएम मानचित्र 5,6,7,8,9,10 का उपयोग करते हैं।

हालांकि एक्सआरडी प्रोटीन-लिगैंड परिसरों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण में स्वर्ण मानक तकनीक रही है, पोस्ट रिज़ॉल्यूशन-क्रांति¹¹ क्रायोईएम ने गति प्राप्त की है, जैसा कि पिछले^{कुछ वर्षों में} इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटाबेस (ईएमडीबी)12,13में जमा कूलम्ब संभावित मानचित्रों या क्रायोईएम मानचित्रों की वृद्धि से संकेत मिलता है। नमूना तैयार करने, इमेजिंग और डेटा प्रोसेसिंग विधियों में प्रगति के कारण, क्रायोईएम को नियोजित करने वाले प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) ¹⁴ जमाओं की संख्या 0.7 और 17 के बीच 2010% से बढ़कर 2020% हो गई, 50 में लगभग 2020% रिपोर्ट की गई संरचनाएं 3.5 ए रिज़ॉल्यूशन या बेहतर^15,16 पर निर्धारित की जा रही हैं। क्रायोईएम को फार्मास्युटिकल उद्योग सहित संरचनात्मक जीव विज्ञान समुदाय द्वारा तेजी से अपनाया गया है, क्योंकि यह लचीले और गैर-क्रिस्टलीय जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन और बहु-प्रोटीन परिसरों के अध्ययन की अनुमति देता है, निकट-परमाणु संकल्प पर, क्रिस्टलीकरण की प्रक्रिया पर काबू पाने और एक्सआरडी द्वारा उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए आवश्यक अच्छी तरह से विवर्तन क्रिस्टल प्राप्त करना।

क्रायोईएम मानचित्र में लिगैंड का सटीक मॉडलिंग सर्वोपरि है, क्योंकि यह आणविक स्तर पर प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स के ब्लूप्रिंट के रूप में कार्य करता है। एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी में उपयोग किए जाने वाले कई स्वचालित लिगैंड-बिल्डिंग टूल हैं जो इलेक्ट्रॉन घनत्व ^{17,18,19,20में} लिगैंड को फिट या बनाने के लिए लिगैंड घनत्व के आकार और टोपोलॉजी पर निर्भर करते हैं। फिर भी, यदि संकल्प 3 ए से कम है, तो ये दृष्टिकोण कम वांछनीय परिणाम उत्पन्न करते हैं क्योंकि टोपोलॉजिकल विशेषताएं जिन पर वे मान्यता और निर्माण के लिए निर्भर करते हैं, कम परिभाषित हो जाते हैं। कई उदाहरणों में, ये विधियां क्रायोईएम मानचित्रों में लिगेंड को सटीक रूप से मॉडलिंग करने में अप्रभावी साबित हुई हैं, क्योंकि इन मानचित्रों को निम्न-से-मध्यम रिज़ॉल्यूशन रेंज में निर्धारित किया गया है, आमतौर पर 3.5 Å-5 Å¹⁷ के बीच।

क्रायोईएम द्वारा प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स के 3 डी संरचना निर्धारण में पहला कदम या तो प्रोटीन के साथ लिगैंड को सह-शुद्ध करना शामिल है (जब लिगैंड का प्रोटीन के लिए उच्च बाध्यकारी संबंध होता है) या ग्रिड तैयारी से पहले एक विशिष्ट अवधि के लिए लिगैंड के साथ प्रोटीन समाधान को इनक्यूबेट करना। इसके बाद, एक छोटा सा नमूना मात्रा एक प्लाज्मा-साफ छेद वाले टीईएम ग्रिड पर रखा जाता है, इसके बाद तरल ईथेन में फ्लैश फ्रीजिंग और अंततः क्रायो-टीईएम के साथ इमेजिंग होती है। मैक्रोमोलेक्यूल के 3-आयामी (3 डी) कूलम्ब संभावित मानचित्र के पुनर्निर्माण के लिए सैकड़ों हजारों से लाखों व्यक्तिगत कणों तक 2 डी प्रक्षेपण छवियों का औसत निकाला जाता है। इन मानचित्रों में लिगेंड और विलायक अणुओं की पहचान और मॉडलिंग करना मानचित्र में अनिसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन के कारण कई मामलों में महत्वपूर्ण चुनौतियों का सामना करता है (यानी, रिज़ॉल्यूशन मैक्रोमोलेक्यूल में एक समान नहीं है), उस क्षेत्र में लचीलापन जहां लिगैंड बाध्य है, और डेटा में शोर। एक्सआरडी के लिए विकसित किए गए कई मॉडलिंग, शोधन और विज़ुअलाइज़ेशन टूल अब क्रायोईएम में उपयोग के लिए समान उद्देश्यों 18,19,20,21के लिए अनुकूलित किए जा रहे हैं। इस लेख में, वर्तमान में लिगेंड की पहचान करने, मॉडल बनाने और क्रायोईएम से प्राप्त निर्देशांक को परिष्कृत करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न तरीकों और सॉफ़्टवेयर का अवलोकन प्रस्तुत किया गया है। अलग-अलग रिज़ॉल्यूशन और जटिलता के साथ विशिष्ट प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स का उपयोग करके लिगैंड मॉडलिंग में शामिल प्रक्रियाओं को चित्रित करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है।

क्रायोईएम मानचित्रों में लिगेंड मॉडलिंग में पहले चरण में मानचित्र में लिगैंड घनत्व (गैर-प्रोटीन) की पहचान शामिल है। यदि लिगैंड बाइंडिंग प्रोटीन में किसी भी रचनात्मक परिवर्तन को प्रेरित नहीं करता है, तो प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स और एपो-प्रोटीन के बीच एक साधारण अंतर मानचित्र की गणना अनिवार्य रूप से अतिरिक्त घनत्व के क्षेत्रों को उजागर करती है, जो लिगैंड की उपस्थिति का सुझाव देती है। इस तरह के अंतर तुरंत देखे जा सकते हैं, क्योंकि इसके लिए केवल दो मानचित्रों की आवश्यकता होती है, और यहां तक कि 3 डी शोधन की प्रक्रिया के दौरान मध्यवर्ती मानचित्रों का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि लिगैंड मौजूद है या नहीं। इसके अतिरिक्त, यदि रिज़ॉल्यूशन काफी अधिक है (<3.0 Å), तो अंतर मानचित्र पानी के अणुओं के स्थान के साथ-साथ लिगैंड और प्रोटीन अवशेषों के साथ बातचीत करने वाले आयनों में अंतर्दृष्टि भी प्रदान कर सकता है।

एपो-प्रोटीन मानचित्र की अनुपस्थिति में, अब सर्वलकैट²² का उपयोग करना संभव है, जो एक स्टैंडअलोन टूल के रूप में उपलब्ध है और इसे रेफमैक शोधन के हिस्से के रूप में सीसीपी-ईएम सॉफ्टवेयर सूट^23,24 में और सीसीपी 4 8.0 रिलीज^25,26 में भी एकीकृत किया गया है। Servalcat इनपुट के रूप में अनशार्प किए गए अर्ध-मानचित्रों और एपोप्रोटीन मॉडल का उपयोग करके FSC भारित अंतर (Fo-Fc) मानचित्र की गणना की अनुमति देता है। Fo-Fc लोप मानचित्र प्रायोगिक मानचित्र (Fo) और मॉडल (Fc) से प्राप्त मानचित्र के बीच असमानता का प्रतिनिधित्व करता है। मॉडल में एक लिगैंड की अनुपस्थिति में, एक Fo-Fc मानचित्र में एक सकारात्मक घनत्व जो प्रयोगात्मक EM मानचित्र के साथ ओवरलैप होता है, आमतौर पर लिगैंड की उपस्थिति का सुझाव देता है। यहां धारणा यह है कि प्रोटीन श्रृंखला मानचित्र में अच्छी तरह से फिट है, और शेष सकारात्मक घनत्व लिगैंड के स्थान को इंगित करता है। हालांकि, सावधानीपूर्वक जांच करना महत्वपूर्ण है कि क्या सकारात्मक घनत्व मॉडलिंग अशुद्धियों से उपजा है, जैसे कि प्रोटीन साइड-चेन का गलत रोटामर।

दूसरे चरण में उपलब्ध रासायनिक जानकारी से अच्छी तरह से परिभाषित ज्यामिति के साथ लिगैंड की एक कार्टेशियन समन्वय फ़ाइल प्राप्त करना या बनाना शामिल है। मानक लिगेंड (उदाहरण के लिए, एटीपी और एनएडीपी⁺) जो पहले से ही CCP4 मोनोमर लाइब्रेरी में उपलब्ध हैं, का उपयोग उनके मोनोमर परिग्रहण कोड के माध्यम से समन्वय और ज्यामिति फ़ाइलों को पुनः प्राप्त करके शोधन के लिए किया जा सकता है। हालांकि, अज्ञात या गैर-मानक लिगेंड के लिए, ज्यामिति फ़ाइलों को बनाने के लिए विभिन्न उपकरण उपलब्ध हैं। कुछ उदाहरणों में eLBOW²⁷ – (इलेक्ट्रॉनिक लिगैंड बिल्डर और ऑप्टिमाइज़ेशन वर्कबेंच) फेनिक्स²⁸ में, Lidia – Coot²⁹ में एक इन-बिल्ट टूल, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep^32-A मॉड्यूल शामिल हैं श्रोडिंगर सूट के भीतर ग्लाइड। लिगैंड समन्वय फ़ाइल को तब घनत्व में फिट किया जाता है, जो प्रयोगात्मक क्रायोईएम मानचित्र और कूट में अंतर मानचित्र दोनों द्वारा निर्देशित होता है। इसके बाद फेनिक्स²⁸ में वास्तविक अंतरिक्ष शोधन या रेफमैक³³ में पारस्परिक शोधन होता है। एक लिनक्स वर्कस्टेशन या एक अच्छे ग्राफिक्स कार्ड से लैस लैपटॉप और उपर्युक्त सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है। इनमें से अधिकांश कार्यक्रम विभिन्न सुइट्स में शामिल हैं। CCP-EM²⁴और Phenix²⁸ अकादमिक उपयोगकर्ताओं के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं और इसमें इस लेख में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न प्रकार के उपकरण शामिल हैं, जिनमें Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, आदि शामिल हैं। इसी तरह, Chimera³⁷, और ChimeraX³⁸ अकादमिक उपयोगकर्ताओं को मुफ्त लाइसेंस प्रदान करते हैं।

Protocol

1. माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस से एनोलेज में फॉस्फोनिओलफ्रूवेट (पीईपी) मॉडलिंग पीईपी-एनोलेज कॉम्प्लेक्स के क्रायोईएम मानचित्र में लिगैंड घनत्व की पहचानEMDB में अतिरिक्त डेटा से apo-enola…

Representative Results

उदाहरण 1एम. तपेदिक से एंजाइम enolase ग्लाइकोलाइसिस के penultimate कदम उत्प्रेरित और कई चयापचय रास्ते44,45 के लिए एक आवश्यक मध्यवर्ती है जो phosphoenolpyruvate (पीईपी), के लिए 2-phosphoglycerate धर्मान्तरित. ए?…

Discussion

माइक्रोस्कोप हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर में सुधार के परिणामस्वरूप हाल के वर्षों में क्रायोईएम संरचनाओं की संख्या में वृद्धि हुई है। हालांकि एकल कण क्रायोईएम में इस समय प्राप्त उच्चतम रिज़ॉल्यूशन 1.2 Å 57,58,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SJ DAE-TIFR से पीएचडी छात्रवृत्ति का प्राप्तकर्ता है, और धन स्वीकार किया जाता है। केआरवी डीबीटी बी-लाइफ ग्रांट डीबीटी/PR12422/एमईडी/31/287/2014 और परमाणु ऊर्जा विभाग, भारत सरकार के समर्थन को परियोजना पहचान संख्या 2014 के तहत स्वीकार करता है। RTI4006।

Materials

CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more

References

Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514 (2018).
Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM’: electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164 (2023).
Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
Debreczeni, J. &. #. 2. 0. 1. ;., Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , (2022).
Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera – A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. 생화학. 62 (3), 735-746 (2023).
Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648 (2021).
Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309 (2019).
Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98 (2023).
Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer’s perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

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Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K. R. Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy. J. Vis. Exp. (209), e66310, doi:10.3791/66310 (2024).