Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Shaileshanand Jha; Sucharita Bose; Kutti R. Vinothkumar

doi:10.3791/66310

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생화학

Modellering av ligander till kartor härledda från elektronkryomikroskopi

Published: July 19, 2024

doi:

10.3791/66310

Shaileshanand Jha*¹, Sucharita Bose*², Kutti R. Vinothkumar

¹National Centre for Biological Sciences,Tata Institute of Fundamental Research, ²Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine

Summary

Detta protokoll introducerar de verktyg som finns tillgängliga för modellering av småmolekylära ligander i kryoEM-kartor av makromolekyler.

Abstract

Att dechiffrera protein-ligandinteraktionerna i ett makromolekylärt komplex är avgörande för att förstå den molekylära mekanismen, underliggande biologiska processer och läkemedelsutveckling. Under de senaste åren har kryogen provelektronmikroskopi (cryoEM) dykt upp som en kraftfull teknik för att bestämma makromolekylers strukturer och för att undersöka sättet för ligandbindning vid nära atomär upplösning. Att identifiera och modellera icke-proteinmolekyler i cryoEM-kartor är ofta utmanande på grund av anisotrop upplösning över molekylen av intresse och inneboende brus i data. I den här artikeln introduceras läsarna till olika programvaror och metoder som för närvarande används för ligandidentifiering, modellbygge och förfining av atomkoordinater med hjälp av utvalda makromolekyler. Ett av de enklaste sätten att identifiera närvaron av en ligand, som illustreras med enolasenzymet, är att subtrahera de två kartorna som erhållits med och utan liganden. Den extra densiteten hos liganden kommer sannolikt att sticka ut i skillnadskartan även vid ett högre tröskelvärde. Det finns fall, som visas i fallet med metabotropisk glutamatreceptor mGlu₅, då sådana enkla differenskartor inte kan genereras. Den nyligen introducerade metoden för att härleda Fo-Fc utelämna-kartan kan fungera som ett verktyg för att validera och demonstrera närvaron av liganden. Slutligen, med det välstuderade β-galaktosidaset som exempel, analyseras effekten av upplösning på modellering av ligander och lösningsmedelsmolekyler i cryoEM-kartor, och en utblick över hur cryoEM kan användas i läkemedelsutveckling presenteras.

Introduction

Celler utför sina funktioner genom att utföra otaliga kemiska reaktioner samtidigt och oberoende, var och en noggrant reglerad för att säkerställa deras överlevnad och anpassningsförmåga som svar på miljösignaler. Detta uppnås genom molekylär igenkänning, vilket gör det möjligt för biomolekyler, särskilt proteiner, att bilda transienta eller stabila komplex med andra makromolekyler såväl som små molekyler eller ligander¹. Således är protein-ligandinteraktioner grundläggande för alla processer inom biologin, som inkluderar reglering av proteinuttryck och aktivitet, igenkänning av substrat och kofaktorer av enzymer, samt hur celler uppfattar och vidarebefordrar signaler ^1,2. En bättre förståelse av de kinetiska, termodynamiska och strukturella egenskaperna hos protein-ligandkomplexet avslöjar den molekylära grunden för ligandinteraktion och underlättar också rationell läkemedelsdesign genom att optimera läkemedelsinteraktion och specificitet. Ett ekonomiskt och snabbare tillvägagångssätt för att studera protein-ligandinteraktion är att använda molekylär dockning, vilket är en beräkningsmetod som virtuellt screenar ett brett spektrum av små molekyler och förutsäger bindningssättet och affiniteten hos dessa ligander till målproteiner³. Experimentella bevis från högupplösta strukturer bestämda med röntgendiffraktion (XRD), kärnmagnetisk resonans (NMR) eller elektronkryomikroskopi (cryoEM) ger dock det väsentliga beviset för sådana förutsägelser och hjälper till att utveckla nyare och mer effektiva aktivatorer eller hämmare för ett givet mål. I den här artikeln används förkortningen “cryoEM” som tekniken ofta kallas. Det pågår dock en debatt om att välja rätt nomenklatur, och nyligen har termen kryo-genic-sample Electron Microscopy (cryoEM) föreslagits för att indikera att provet har kryogen temperatur och avbildas med elektroner⁴. På samma sätt har kartorna som härrör från cryoEM kallats elektronpotential, elektrostatisk potential eller Coulombpotential, och för enkelhetens skull använder vi här cryoEM-kartor 5,6,7,8,9,10.

Även om XRD har varit den gyllene standardtekniken inom högupplöst strukturbestämning av protein-ligandkomplex, har kryoEM efter upplösningsrevolutionen¹¹ tagit fart, vilket indikeras av ökningen av Coulomb-potentialkartor eller kryoEM-kartor som deponerats i elektronmikroskopidatabasen (EMDB)^12,13 under de senaste åren¹⁴. På grund av framsteg inom provberedning, avbildning och databehandlingsmetoder ökade antalet Protein Data Bank (PDB)^{14-depositioner} som använder kryoEM från 0,7 % till 17 % mellan 2010 och 2020, med cirka 50 % av rapporterade strukturer 2020 som bestämdes till 3,5 Å upplösning eller bättre^15,16. CryoEM har snabbt antagits av strukturbiologin, inklusive läkemedelsindustrin, eftersom det möjliggör studier av flexibla och icke-kristallina biologiska makromolekyler, särskilt membranproteiner och multiproteinkomplex, med nästan atomär upplösning, vilket övervinner kristallisationsprocessen och erhåller väl diffrakterande kristaller som krävs för högupplöst strukturbestämning med XRD.

Noggrann modellering av liganden i cryoEM-kartan är av största vikt, eftersom den fungerar som en ritning av protein-ligandkomplexet på molekylär nivå. Det finns flera automatiserade ligandbyggande verktyg som används inom röntgenkristallografi som beror på formen och topologin för liganddensiteten för att passa eller bygga in liganden i elektrondensiteten 17,18,19,20. Icke desto mindre, om upplösningen är lägre än 3 Å, tenderar dessa metoder att ge mindre önskvärda resultat eftersom de topologiska egenskaper som de är beroende av för igenkänning och uppbyggnad blir mindre definierade. I många fall har dessa metoder visat sig vara ineffektiva när det gäller att exakt modellera ligander till kryoEM-kartor, eftersom dessa kartor har bestämts i intervallet låg till medelhög upplösning, vanligtvis mellan 3,5 Å-5 Å¹⁷.

Det första steget i 3D-strukturbestämning av ett protein-ligandkomplex med cryoEM innebär att antingen samrena liganden med proteinet (när liganden har en hög bindningsaffinitet till proteinet) eller inkubera proteinlösningen med liganden under en viss tid innan rutnätsberedning. Därefter placeras en liten provvolym på ett plasmarengjort håligt TEM-galler, följt av snabbfrysning i flytande etan och slutligen avbildning med en kryo-TEM. 2D-projektionsbilderna från hundratusentals till miljontals enskilda partiklar beräknas som medelvärden för att rekonstruera en 3-dimensionell (3D) Coulomb-potentialkarta över makromolekylen. Att identifiera och modellera ligander och lösningsmedelsmolekyler i dessa kartor innebär betydande utmaningar i många fall på grund av den anisotropa upplösningen över kartan (dvs. upplösningen är inte enhetlig över makromolekylen), flexibiliteten i regionen där liganden är bunden och bruset i data. Många av de modellerings-, förfinings- och visualiseringsverktyg som utvecklades för XRD anpassas nu för användning i cryoEM för samma ändamål 18,19,20,21. I den här artikeln presenteras en översikt över olika metoder och programvara som för närvarande används för att identifiera ligander, bygga modeller och förfina koordinaterna som härrör från cryoEM. Ett steg-för-steg-protokoll har tillhandahållits för att illustrera de processer som är involverade i modellering av ligander med hjälp av specifika protein-ligandkomplex med varierande upplösning och komplexitet.

Det första steget i modellering av ligander i kryoEM-kartor inkluderar identifiering av ligandens densitet (icke-protein) i kartan. Om ligandbindning inte inducerar någon konformationsförändring i proteinet, framhäver beräkningen av en enkel skillnadskarta mellan protein-ligandkomplexet och apo-proteinet i huvudsak regionerna med extra densitet, vilket tyder på närvaron av liganden. Sådana skillnader kan observeras omedelbart, eftersom det bara krävs två kartor, och till och med mellanliggande kartor under processen med 3D-förfining kan användas för att kontrollera om liganden är närvarande. Dessutom, om upplösningen är tillräckligt hög (<3,0 Å), kan differenskartan också ge insikter om platsen för vattenmolekyler samt joner som interagerar med liganden och proteinresterna.

I avsaknad av apo-proteinkartan är det nu möjligt att använda Servalcat²², som är tillgängligt som ett fristående verktyg och som också har integrerats i CCP-EM-mjukvarusviten^23,24 som en del av Refmac-förfiningen och i CCP4 8.0 release^25,26. Servalcat gör det möjligt att beräkna en FSC-viktad differenskarta (Fo-Fc) med hjälp av de oskarpa halvavbildningarna och apoproteinmodellen som indata. Den utelämnade Fo-Fc-kartan representerar skillnaden mellan den experimentella kartan (Fo) och kartan som härleds från modellen (Fc). I frånvaro av en ligand i modellen tyder en positiv densitet i en Fo-Fc-karta som överlappar med den experimentella EM-kartan vanligtvis på närvaron av liganden. Antagandet här är att proteinkedjan är väl anpassad på kartan, och den återstående positiva densiteten indikerar platsen för liganden. Det är dock viktigt att noggrant undersöka om den positiva densiteten härrör från modelleringsfelaktigheter, till exempel fel rotamer av en proteinsidokedja.

Det andra steget innebär att erhålla eller skapa en kartesisk koordinatfil av liganden med väldefinierad geometri från den tillgängliga kemiska informationen. Standardligander (till exempel ATP och NADP⁺) som redan finns tillgängliga i CCP4-monomerbiblioteket kan användas för förfining genom att hämta koordinat- och geometrifilerna via deras monomeranslutningskod. För okända eller icke-standardiserade ligander finns dock olika verktyg tillgängliga för att skapa geometrifilerna. Några av exemplen är eLBOW²⁷ – (electronic ligand builder and optimization workbench) i Phenix²⁸, Lidia – ett inbyggt verktyg i Coot²⁹, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep 32-a-modulen av Glide inom Schrödinger-sviten. Ligandkoordinatfilen passas sedan in i densiteten, styrd av både den experimentella cryoEM-kartan och differenskartan i Coot. Detta följs av real-space refinement i Phenix²⁸ eller reciprok refining i Refmac³³. En Linux-arbetsstation eller en bärbar dator utrustad med ett bra grafikkort och ovan nämnda programvara krävs. De flesta av dessa program ingår i olika sviter. CCP-EM²⁴och Phenix²⁸ är fritt tillgängliga för akademiska användare och inkluderar en mängd olika verktyg som används i den här artikeln, inklusive Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. På samma sätt ger Chimera³⁷ och ChimeraX³⁸ gratis licenser till akademiska användare.

Protocol

1. Modellering av fosfoenolpyruvat (PEP) i enolas från Mycobacterium tuberculosis Identifiering av liganddensitet i kryoEM-kartan för PEP-enolaskomplexLadda ner de oskarpa halvkartorna (emd_30988_additional_1.map och emd_30988_additional_2.map) av apo-enolase från ytterligare data i EMDB (se Materialtabell). Öppna ChimeraX (se Materialförteckning). Öppna halvkartorna av apo-enolase genom att klicka på Öppna i…

Representative Results

Exempel 1Enzymet enolas från M. tuberculosis katalyserar det näst sista steget i glykolysen och omvandlar 2-fosfoglycerat till fosfoenolpyruvat (PEP), som är en viktig intermediär för flera metaboliska vägar44,45. CryoEM-data för apo-enolas- och PEP-bundna enolasprover samlades in vid samma pixelstorlek på 1,07 Å, och bildbehandling utfördes med Relion 3.146,47. Str…

Discussion

Förbättringarna i hårdvara och mjukvara för mikroskop har resulterat i en ökning av antalet kryoEM-strukturer under de senaste åren. Även om den högsta upplösningen som för närvarande uppnås i kryoEM med en partikel är 1,2 Å 57,58,59, bestäms majoriteten av strukturerna runt 3-4 Å upplösning. Modellering av ligander i kartor med medelhög till låg upplösning kan vara knepigt och ofta fyllt av tvetydighet. Med …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SJ är mottagare av doktorandtjänsten från DAE-TIFR, och finansieringen är erkänd. KRV erkänner DBT B-Life-anslaget DBT/PR12422/MED/31/287/2014 och stödet från Department of Atomic Energy, Indiens regering, under projektidentifikationsnummer. RTI4006.

Materials

CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more

References

Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514 (2018).
Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM’: electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164 (2023).
Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
Debreczeni, J. &. #. 2. 0. 1. ;., Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , (2022).
Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera – A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. 생화학. 62 (3), 735-746 (2023).
Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648 (2021).
Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309 (2019).
Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98 (2023).
Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer’s perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K. R. Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy. J. Vis. Exp. (209), e66310, doi:10.3791/66310 (2024).