아데노 관련 바이러스는 현탁 세포 배양에서 생성되며 이중 요오드화놀 밀도 구배 원심분리로 정제됩니다. 총 바이러스 수율을 높이고, 바이러스 침전의 위험을 줄이고, 최종 바이러스 산물을 더욱 농축하기 위한 단계가 포함되어 있습니다. 예상되는 최종 역가는10,12 바이러스 입자/mL에 도달하며 전임상 in vivo 사용에 적합합니다.
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방법 논문
In Vivo 응용 분야를 위한 Iodixanol Density Gradient Centrifugation에 의한 아데노 관련 바이러스의 현탁 배양 생산 및 정제
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 1999년에 처음 기술된 AAV를 정제하는 혈청형에 구애받지 않는 방법인 요오드릭사놀 밀도 구배 원심분리에 의한 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 생산 및 정제에 대해 설명합니다. rAAV 벡터는 다양한 인간 세포 유형에 전이유전자를 전달하기 위한 유전자 치료 응용 분야에서 널리 사용됩니다. 이 연구에서 재조합 바이러스는 전이유전자, 벡터 캡시드 및 아데노바이러스 도우미 유전자를 암호화하는 플라스미드를 사용하여 현탁 배양에서 Expi293 세포를 transfection하여 생산됩니다. 요오딕사놀 밀도 구배 원심분리는 입자 밀도를 기반으로 전체 AAV 입자를 정제합니다. 또한, 현재 유비쿼터스가 된 이 방법론에는 총 바이러스 수율을 높이고, 단백질 오염으로 인한 침전 위험을 줄이고, 최종 바이러스 생성물을 더욱 농축하기 위한 세 가지 단계가 포함되어 있습니다: 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 염화나트륨 용액을 사용한 세포 배지에서 바이러스 입자 침전, 요오드릭산올 밀도 구배 원심분리의 두 번째 라운드 도입, 원심 필터를 통한 완충액 교환. 이 방법을 사용하면 in vivo 사용을 위한 탁월한 순도의 1012 바이러스 입자/mL 범위의 역가를 일관되게 달성할 수 있습니다.
서론
재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터는 척수성 근위축증, 망막 이영양증 및 혈우병 A 1,2,3을 포함한 유전 질환 치료에 널리 사용되는 도구입니다. rAAV 벡터는 선형 단일 가닥 4.7kb DNA 게놈을 가진 작고 외피가 없는 이십면체 바이러스인 야생형 AAV4에 존재하는 바이러스 유전자가 없도록 조작되었습니다. AAV는 1960년대에 아데노바이러스 제제의 오염물질로 처음 발견되었다5. AAV는 ITR을 제외하고 최대 4.9 kb로 패키징할 수 있는 전이유전자의 크기를 제한하는 작은 캡시드 크기에도 불구하고6, 인간에서 비병원성이고, 많은 분열 및 비분열 세포 유형에서 전이유전자 발현을 허용하며, 면역원성 효과가 제한적이기 때문에 전이유전자 전달에 유용하다7.
레의존파보바이러스(dependoparvovirus) 속의 구성원인 rAAV의 생산은 아데노바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스(herpes ....
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프로토콜
이 프로토콜에 사용된 용액 및 버퍼의 구성은 표 1에 나와 있습니다.
| 용액 | 구성 | |
| AAV 용해 완충액 | 5M NaCl 용액 1.2mL | |
| 2M Tris-HCl pH 1 용액 8.5mL | ||
| 80 uL의 1 M MgCl2 용액 | ||
| mQ 물을 40mL까지 | ||
| AAV 침전 용액 | 40 g 나무 못 8000 | |
| 5M NaCl 용액 50mL | ||
| mQ 물에서 100mL까지 | ||
| 1.... | ||
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결과
이 방법은 mL당 최소10,12개의 바이러스 입자의 역가를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 역가는 보충 표 1에 제공된 ITR 프라이머를 사용하는 qPCR, ddPCR 또는 기타 적정 방법으로 얻을 수 있습니다(그림 3). 최적이 아닌 역가는 패키징 효율이 좋지 않은 캡시드를 암호화하는 캡 유전자를 사용하여 발생할 수 있습니다.
차선의 결과를 얻을 수 있는 또 다른 원인은 Expi293 세포의 형질도입 효율이 낮다는 것입니다. transfection 당일에 세포 밀도가 3-4 x 106 vc/mL이고 세포 생존율이 98%에 가까운 것이 좋습니다. 본 연구에서 저자는 이 프로토콜에 따라 1.07 x 1012 vg의 역가를 얻었습니다. 이 출력량은 AAVrh7418 포장에서 얻은 이전 .......
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토론
이중 요오드산올 밀도 구배 정제 프로토콜은 수용체 특이성에 관계없이 모든 AAV 돌연변이 변이체에 적용할 수 있기 때문에 보편적인 방법입니다. AAV 정제의 초기 방법은 입자 밀도에 의존하고 CsCl에서의 isopycnic 원심분리 및 연속 자당 밀도 구배 원심분리를 포함하였다19. 나중에, 혈청형 특이적 접근법이 개발되었는데, 이는 세파로스 컬럼20에 결합된 단클론 항체를 사용하였다. 불연속 요오딕산올 구배를 사용하는 새로운 밀도 기반 정제 방법이 1999년에 개발되었으며 CsCl 구배에서 분리한 것보다 더 높은 감염성을 가진 AAV 분리물을 수득했습니다21. AAV를 정제하는 방법은 2000년대 초반까지 계속 개발되었으며, 일부 그룹은 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 70%를 초과하는 미처리 용해물에서 회수되는 rAAV를 정제했습니다22,23,24.<.......
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공개 사항
저자는 보고할 공개가 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5810 R 벤치탑 원심분리기 | Eppendorf | 22625501 | |
| 8채널 연동 펌프 | 왓슨말로우 | 020.3708.00A | |
| 자동 세포 계수기 | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E 고속 원심분리기 | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| 생물 안전 캐비닛 | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | 8% CO2 및 37°C로 설정; C | ||
| 원뿔형 원심분리기 튜브 | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| 원뿔형 원심분리기 튜브 | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| 일회용 마이크로 피펫 | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수(CaCl2 및 MgCl2 (디펜스) (10배) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL 도립 현미경 | Nikon | ||
| Expi293 표현 매체 | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F 세포 | Gibco | A14527 | |
| 필터 팁 | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µ L |
| 필터 팁 | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µ L |
| 필터 팁 | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µ L |
| 필터 팁 | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µ L |
| 하이포더믹 니들 | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| 얼음 양동이 뚜껑 | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 로터 | Beckman Coulter | 368690 | |
| 마그네슘 클로라이드 용액 (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| 메탈 스탠드 및 클램프 | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| 니들 노즈 플라이어 | |||
| Optima XE-90 초원심분리기 | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep 밀도 구배 배지(요오딕산올) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% 요오딕산올 용액 |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| 페놀 레드 용액 | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP 피펫 컨트롤러 | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo 또는 Addgene 등 | N/A | 우리는 pACGrh74를 사용했습니다. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo 또는 Addgene 등 | N/A | 우리는 pdsAAV-GFP를 사용했습니다. |
| Pluronic F-68 폴리올 용액 (10 %) | MP Biomedicals | 92750049 | |
| 폴리에틸렌 글리콜 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| 폴리 에틸 렌 이민 HCl 최대 (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | 물에 희석 40 μ M |
| 폴리프로필렌 원심분리기 튜브, 멸균 | Corning | 431123 | 500 mL |
| 폴리프로필렌 원심분리 튜브, 멸균 | Corning | 430776 | 250 mL |
| 폴리프로필렌 Optiseal 튜브 | Beckman Coulter | 361625 | |
| 혈청학 피펫 | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| 혈청학 피펫 | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| 혈청학 피펫 | 알칼리 Scientific | SP210-B | 10 mL |
| 혈청학 피펫 | 알칼리 Scientific | SP205-B | 5 mL |
| 셰이커 플라스크 | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| 셰이커 플라스크 | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| 셰이커 플라스크 | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| 셰이커 플라스크 | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| 염화나트륨 용액 (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| 멸균 주사기 | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| 주사기 필터 | Millipore | SLGV013SL | 0.22 미크론 |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue 해결책 | Gibco | 15250061 | |
| 튜브 랙 어셈블리 | Beckman Coulter | 361646 | |
| 튜브 스페이서(x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| 연동 펌프용 튜빙 | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti 고정각 티타늄 로터 | Beckman Coulter | 337922 | |
| 초저온 냉동고 | -70으로 설정 ° C | ||
| Vivaspin 20 원심 집중 | Sartorius | VS2041 | |
| 수조 | 37 °로 설정; 씨 |
참고문헌
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S.
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재인쇄 및 허가
