卵巢癌类器官的生物样本库策略：解决跨组织学亚型和疾病阶段的患者间异质性
Summary
该协议为建立来自不同疾病阶段的卵巢癌类器官提供了一个系统框架，并解决了患者特异性变异性的挑战，以提高产量并为后续应用实现稳健的长期扩展。它包括组织处理、接种、调整培养基要求和免疫荧光染色的详细步骤。
Abstract
虽然从患者来源的类器官及其临床背景信息中建立卵巢癌生物库有望在研究和患者护理方面取得进展，但由于这种致命恶性肿瘤的异质性，加上类器官技术固有的复杂性，标准化仍然是一个挑战。这种适应性强的方案提供了一个系统框架，考虑到祖细胞的患者特异性变异性，以实现卵巢癌类器官的全部潜力。通过实施结构化的实验工作流程来选择最佳培养条件和接种方法，并同时测试直接 3D 接种与 2D/3D 路线，在大多数情况下，我们获得了适用于各种下游应用的稳健的长期膨胀系。
值得注意的是，该方案已在大量高度异质的起始材料病例 （N = 120） 中经过测试并证明有效，包括高级别和低级别卵巢癌以及原发性减瘤、复发性疾病和新辅助手术标本的疾病阶段。在低 Wnt、高 BMP 的外源信号转导环境中，我们观察到祖细胞对 Heregulin 1 ß （HERß-1） 通路的激活具有不同的敏感性，其中 HERß-1 促进某些类器官的形成，而抑制另一些类器官的形成。对于患者样本的一部分，最佳的类器官形成和长期生长需要向培养基中添加成纤维细胞生长因子 10 和 R-Spondin 1。
此外，我们强调了组织消化和祖细胞分离的关键步骤，并指出了在塑料上进行 2D 短暂培养有利于基底膜提取物 2 型基质中后续类器官形成的例子。总体而言，最佳生物样本库需要同时对所有主要条件进行系统测试，以确定单个品系的适当生长环境。该协议还描述了有效包埋、切片和染色以获得类器官的高分辨率图像的处理程序，这是综合表型分析所必需的。
Introduction
由于上皮性卵巢癌晚期临床表现异质性和高复发率，其临床管理仍然具有挑战性1。提高我们对卵巢癌发展和生物学行为的理解需要研究方法，以解决疾病过程中患者的特异性变异性、治疗反应以及组织病理学和分子特征2。
生物样本库的特点是系统地收集和长期保存卵巢癌患者的肿瘤样本及其临床信息，为处于不同疾病阶段的大量患者群体提供保存，包括来自初次减瘤手术、新辅助化疗后和复发性疾病的肿瘤样本。它具有推进癌症研究的宝贵潜力，可作为有前途的预后生物标志物和治疗靶点的资源3。然而，传统的生物样本库方法，如福尔马林固定和冷冻，由于活力的丧失和天然三维组织结构的破坏，不适合对原始肿瘤样本进行功能研究4,5。
肿瘤学及其他领域的分子机制研究在很大程度上取决于使用适当的实验模型，这些模型忠实地反映了疾病的生物学特性，并保持了体内观察到的组织的体外特性。基于保留更新潜力的患者来源类器官，在实验室中复制上皮细胞的原始结构和功能，并允许在患者特定环境中进行测试。因此，它们已成为癌症研究和个性化医疗的非常有前途的工具，弥合了临床多样性和实验室研究之间的差距6,7,8,9。基于类器官系的个体药物反应和分子图谱的功能相关性测试的定制治疗策略，可以潜在地直接应用于患者护理10,11。长期培养的可能性，包括患者特异性特征，以及随着时间的推移收集相关的前瞻性临床数据，对于确定与疾病进展和耐药机制有关的新的预后和预测因素具有很大的希望3,9。
尽管如此，建立一个包含来自不同肿瘤样本的类器官的生物库需要严格遵守复杂的方法，并建立易于维护的方案12。流程标准化确保即使在高流动率下，训练有素的员工也能有效地建立和维护生物样本库，同时遵守最高质量标准13.几项研究报告了与原始肿瘤的突变和表型特征相对应的稳定卵巢癌类器官系的成功生成，且效率各不相同。尽管如此，常规生物样本库在实践中仍然具有挑战性，特别是对于细胞系的长期稳定生长，这是大规模扩增或成功基因组编辑的先决条件。
特别是，可扩展性问题在该领域仍然定义模糊，因为显示出缓慢和有限的生长潜力的类器官偶尔被算作已建立的品系。正如 Hoffmann 等人最初证明的那样，该研究的主要发现为这一进一步发展的方案提供了基础，卵巢癌组织的最佳处理需要一种独特的策略来适应异质性14。通过成熟培养物的 DNA 测序和转录组学分析（培养 4-10 个月）证实了通过该方法获得的类器官的表型表征以及与亲本肿瘤组织的密切相似性，证明了模型的稳定性 8、9、12、14。
与调节健康输卵管稳态的旁分泌环境相比，上皮层可能产生高级别浆液性卵巢癌 （HGSOC）、癌症再生潜力和类器官形成能力，对外源性 Wnt 补充的依赖性较小。此外，以类器官培养基中不存在 Noggin 为特征的活性骨形态发生蛋白 （BMP） 信号转导被证明有利于从卵巢癌实体组织沉积物中建立长期培养物14,15。在卵巢癌固体沉积物的系统生物样本库期间，我们已经证实了这些发现并建立了管道，该协议中概述了详细信息，以确保在大多数情况下持续长期扩展。我们发现，在使用原代分离株时，对不同培养基组成和接种方式进行平行测试对于改善长期稳定的类器官系的建立和提高产量至关重要，从而能够稳健地繁殖和扩展到下游实验所需的多孔形式16。
此外，手术过程中收集的样本的纯度和质量对于卵巢癌类器官在基础研究和分子诊断中的转化潜力至关重要。HGSOC 临床表现的复杂性要求外科医生、肿瘤学家和实验室科学家之间的密切合作，以确保正确识别相关材料，保持运输条件恒定，并高效生成类器官系，代表每个患者疾病的最重要特征。考虑到卵巢癌的异质性，该协议提供了一个标准化但适应性强的框架，以捕获卵巢癌类器官的全部潜力16,17。值得注意的是，该协议能够对广泛的卵巢癌临床表现进行可靠的生物样本库，包括不同的组织学类型（高级别和低级别卵巢癌，LGSOC），来自同一患者的不同沉积物，这些患者在干性调节方面表现出差异，来自新辅助治疗后手术的组织，活检材料，以及来自疾病进展复发期的手术样本。
Protocol
Representative Results
Discussion
所设计的方案解决了卵巢癌类器官生物样本库在类器官形成和长期传代潜力方面的先前挑战，并确保从大多数实体瘤沉积物中产生完全可扩展的细胞系。用于类器官生成的肿瘤样本的手术采集过程显着影响产量和扩增潜力。肿瘤组织样本可以在各种手术中获得，包括多脏器手术、诊断性腹腔镜检查或活检。有经验的妇科肿瘤外科医生应优先从腹膜位置获取干净的肿瘤样本。值得注意的是，已经观?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该研究由德国癌症研究中心 DKTK 资助，合作伙伴网站慕尼黑，DKFZ 和慕尼黑大学医院 LMU 之间的合作伙伴关系。该研究还得到了德国癌症援助基金（#70113426和#70113433）的支持。组织和类器官的石蜡包埋已在慕尼黑慕尼黑大学医学院解剖学研究所的核心设施中进行。共聚焦成像已在生物医学中心 （BMC） 的核心设施生物成像中进行。作者要感谢 Simone Hofmann、Maria Fischer、Cornelia Herbst、Sabine Fink 和 Martina Rahmeh 提供的技术帮助。
Materials
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
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