توليد شرائح أنسجة البنكرياس البشرية لدراسة فسيولوجيا البنكرياس الغدد الصماء والخارجية الإفراز
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية توليد شرائح البنكرياس البشري من المتبرعين بالأعضاء المتوفين لدراسة وظيفة الخلية في ظل ظروف شبه فسيولوجية. يتيح هذا النهج المبتكر التحقيق في الجزر العادية والمتضررة هيكليا والتفاعل المعقد بين مقصورات الغدد الصماء والخارجية الإفراز.
Abstract
من الأهمية بمكان دراسة البنكرياس البشري لفهم الآليات الفيزيولوجية المرضية المرتبطة بمرض السكري من النوع 1 (T1D) و 2 (T2D) بالإضافة إلى فسيولوجيا البنكرياس والغدد الصماء والخارجية الإفراز والتفاعل. لقد تم تعلم الكثير من دراسة جزر البنكرياس المعزولة ، ولكن هذا يمنع فحص وظيفتها وتفاعلاتها في سياق الأنسجة بأكملها. توفر شرائح البنكرياس فرصة فريدة لاستكشاف فسيولوجيا الجزر الطبيعية والملتهبة والتالفة هيكليا داخل بيئتها الأصلية ، مما يسمح بدوره بدراسة التفاعلات بين مقصورات الغدد الصماء والخارجية الإفراز للتحقيق بشكل أفضل في الديناميات المعقدة لأنسجة البنكرياس. وبالتالي ، فإن اعتماد منصة شريحة البنكرياس الحية يمثل تقدما كبيرا في هذا المجال. يصف هذا البروتوكول كيفية توليد شرائح الأنسجة الحية من المتبرعين بالأعضاء المتوفين عن طريق تضمين الأنسجة في تقطيع الأغاروز والاهتزاز بالإضافة إلى استخدامها لتقييم القراءات الوظيفية مثل الإفراز الديناميكي وتصوير الخلايا الحية.
Introduction
تعتبر الدراسات حول فسيولوجيا الجزر أساسية لفهم التسبب في مرض السكري وتطوير أساليب علاجية جديدة. حتى الآن ، اعتمدت الأبحاث على الجزر المعزولة ، والتي تعرض الجزر لضغوط ميكانيكية وإنزيمية ، مما يتسبب على الأرجح في حدوث تغييرات في فسيولوجيا الخلية. علاوة على ذلك ، لا يمكن تقييم وظيفة الجزيرة في سياق بيئة الأنسجة الطبيعية ، والتي من المحتمل أن تتأثر بالخلايا الخارجية الإفراز والأوعية الدموية من بين أمور أخرى1. عند دراسة البنكرياس من المتبرعين المصابين ب T1D ، هناك تحد يتمثل في صعوبة عزل جزرها وقد تصبح مجزأة أثناء العزلة ، مما قد ينتج عنه تأثير انتقاء على الجزر الصغيرة التي قد لا تمثل السكان في الجسم الحي2. علاوة على ذلك ، سيتم فصل الجزر عن بيئتها المعقدة واتصالاتها الخلوية ، خاصة من الخلايا المناعية المتسللة الموجودة في الجزر الملتهبة والتي تكون أكثر وفرة في محيط الجزيرة. وبالتالي ، في حين أن الجزر المعزولة هي أداة أساسية في أبحاث مرض السكري ، إلا أن هناك قيودا. استجابة لذلك ، نقدم بروتوكولا رائدا لتوليد شرائح البنكرياس الحية ، وتقديم حل لهذه التحديات.
يعتبر التطور الأخير واعتماد تقنيات تقطيع أنسجة البنكرياس اختراقا لقدرتنا على استكشاف البيولوجيا المعقدة ووظائف البنكرياس. فتح هذا الابتكار آفاقا جديدة للدراسات الديناميكية لفسيولوجيا الجزر والتفاعلات بين خلايا الغدد الصماء والخارجية الإفراز والخلايا العصبية والأوعية الدموية والمناعية في سياقها التشريحي الطبيعي. على عكس الأساليب التقليدية ، يحافظ هذا الإعداد في المختبر على الكثير من الهندسة الخلوية للعضو ، مما يسمح بتقريب أقرب إلى بيولوجيته الأصلية. تم تطوير هذه الطريقة في البداية على الفئران بواسطة Speier و Rupnik في عام 20033 ، وقد أثبتت هذه الطريقة فائدتها في تقييم تصوير الكالسيوم والفيزيولوجيا الكهربية وإفراز الهرمونات لكل من الإشارات داخل الخلايا وبين الخلايا4،5،6،7،8،9. ثم تم تطبيق منصة شريحة البنكرياس لدراسة أنسجة البنكرياس البشرية التي تم الحصول عليها عن طريق الخزعة الجراحية4،10،11،12. أظهرت مجموعتنا جدوى الحصول على شرائح البنكرياس واستخدامها من المتبرعين بالأعضاء الجثة من خلال نشاط شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بداء السكري (nPOD)13. يوفر nPOD أنسجة البنكرياس للمحققين المعتمدين الذين يجرون أبحاثا حول مرض السكري من النوع 1 البشري ، ومنذ اعتماد منصة شريحة البنكرياس ، يقوم nPOD بشكل روتيني بإنشاء وتوزيع شرائح البنكرياس الحية14،15،16،17. منذ تنفيذ منصة شرائح البنكرياس في عام 2020 ، نجحت nPOD في توزيع شرائح الأنسجة من 43 متبرعا (بما في ذلك 12 متبرعا مصابا ب T1D) على العديد من المحققين. باستخدام هذه الشرائح ، أجرى الباحثون أبحاثا رائدة حول الجوانب الحرجة لوظيفة الجزيرة واستكشفوا التفاعل بين الجزر والأوعية الدموية والجهاز العصبي والخلايا المناعية في سياق T1D13،18،19،20،21،22،23،24. سلطت العديد من الدراسات الضوء على قيود الأساليب التقليدية وأكدت على أهمية التقنيات التي يمكنها التقاط التفاعل الديناميكي داخل البنكرياس25،26،27. إن القدرة على التكيف مع تقنيات التقطيع من الفأر إلى البنكرياس البشري ، إلى جانب دمجها في برامج مثل شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بداء السكري (nPOD) ، تجسد الاعتراف المتزايد بقدرة الطريقة على إطلاق رؤى قيمة حول أمراض مثل مرض السكري من النوع 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم هنا بروتوكولا لتوليد شرائح أنسجة البنكرياس القابلة للحياة واستخدامها في القراءات الوظيفية مثل إفراز الهرمونات الديناميكي والتصوير الوظيفي. على غرار عزل الجزر البشرية ، يتأثر نجاح إجراء الشريحة بعوامل مختلفة ، بما في ذلك خصائص المتبرع ، ووقت شحن الأنسجة ، وجودة الأنسجة25,29. لذلك ، من الأهمية بمكان اختيار عينات الأنسجة بعناية للتجربة والحفاظ على أوقات نقص التروية إلى الحد الأدنى. في هذا السياق ، ينبغي النظر بعناية في المصادر المحتملة الأخرى للأنسجة البشرية إلى جانب المتبرعين بالجثث. يوفر تضمين المتبرعين الجراحيين خيار الجمع بين بيانات الشرائح الوظيفية والمعلومات ذات الصلة في الجسم الحي من نفس المريض ، مما يعزز الصلة الانتقالية11. ومع ذلك ، فإن مصدر الأنسجة هذا يجلب عوامل أخرى لأن الخزعات عادة ما تكون من المرضى الأكبر سنا الذين يخضعون لاستئصال البنكرياس في الغالب بسبب ورم موضعي. والجدير بالذكر أن خزعات البنكرياس لا يتم إجراؤها في سياق مرض السكري.
عند إجراء عملية التقطيع الفعلية ، تعد معالجة الأنسجة في الوقت المناسب أمرا بالغ الأهمية. يمكن تخزين الشرائح لعدة ساعات ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، أو استزراعها لفترات طويلة ، كما وصفها قادر وآخرون 19. في الوقت الحاضر ، يقف هذا البروتوكول كطريقة وحيدة للحفاظ على صلاحية الشريحة على مدى فترات طويلة ، ومع ذلك ، يجب أن تقوم الجهود المستقبلية بتقييم التغيرات الوظيفية عبر أوقات الثقافة المتنوعة وإجراء مقارنات مع الجزر المعزولة ، من نفس الجهة المانحة.
الخطوة الأكثر أهمية في العملية هي التحضير الدقيق للأنسجة قبل تضمينها في الأغاروز. يمكن أن تؤدي القنوات الكبيرة والأنسجة الليفية إلى تعقيد عملية التقطيع ومن المحتمل أن تؤدي إلى خروج كتل الأنسجة من الأغاروز. إذا حدث هذا وظلت القطع بحجم معقول ، فيمكن إعادة معالجتها وتضمينها للتقطيع. إن الحفاظ على جودة الأنسجة الجيدة والمعالجة الدقيقة يعزز بشكل كبير من كفاءة إجراء التقطيع وينتج أقصى كمية ونوعية من الشرائح. يجب ألا يتجاوز الوقت المنقضي من تحضير الأنسجة إلى توليد الشرائح 2-3 ساعات ، حيث تؤثر الفترات الأطول بشكل كبير على صلاحية الأنسجة.
أثناء عملية فحص الشرائح، تتمثل الخطوة البسيطة والحاسمة في التشذيب الدقيق للشريحة لضمان ملاءمة مثالية للحجرة. هذا يسمح للاستحمام السليم للأنسجة والتدفق دون انقطاع. بمجرد بدء البروتوكول ، من الضروري تجنب المزيد من التلاعب بالغرف لمنع الطفرات غير المرغوب فيها في إفراز الهرمونات. يجب إعداد عازل كاف ، ويجب أن تصل الأنابيب إلى قاع المحلول لمنع شفط الهواء وجفاف الغرف.
بالنسبة لتصوير الكالسيوم ، من المهم اختيار مجال الاهتمام بعناية ، اعتمادا على الاحتياجات التجريبية والتصميم. من المهم تقليل التبييض الضوئي عن طريق اختيار معلمات التصوير التي تقلل من التعرض للضوء أو تقصر وقت البروتوكول الإجمالي. مثل إفراز الهرمونات الديناميكي ، يعد الحفاظ على تدفق المحلول المناسب والإعداد الساخن أمرا بالغ الأهمية ، حيث تتطلب الشرائح ظروفا شبه فسيولوجية للحصول على الوظيفة المثلى (على سبيل المثال ، 37 درجة مئوية).
تحافظ شرائح أنسجة البنكرياس بشكل فعال على السلامة الهيكلية للبنكرياس ، مما يحافظ على روابط الخلايا الخلوية بين أنواع الخلايا المتنوعة. وبالتالي ، فإنها توفر بديلا للعمل مع الجزر المعزولة ، مما يسهل الاستكشاف المتزامن لكل من وظائف الغدد الصماء والخارجية الإفراز وتفاعلها. لتقييم التفاعل بين أنواع الخلايا الفردية ، من الأهمية بمكان التمييز بينها. يعد التلوين بعد ذلك أحد الخيارات ، ولكن له قيود من حيث مجسات الفلورسنت المتاحة والتحدي المتمثل في تحديد طبقات الخلايا الدقيقة. لذلك ، ينصح بدمج المحفزات الخاصة بالخلية في البروتوكول لتمكين تمييز الخلايا بناء على الاستجابات. للتمييز بين أنواع الخلايا في شرائح الفئران أو البشر ، تشمل المحفزات الفعالة الأدرينالين لخلايا ألفا21,30 ، والجريلين لخلايا دلتا31 ، والسيرولين للخلايا الأسينية 5,32 ، والأحماض الصفراوية للخلايا الأقنية33 ، والنورادرينالين لخلايا الأوعية الدموية22. يمكن استخدام محفزات مماثلة لقياس الاستجابات الإفرازية. بينما تركز دراسات التصوير على الخلايا الفردية ، تحلل دراسات الإفراز الاستجابة الجماعية. وبالتالي ، من الأهمية بمكان تضمين عدد كبير من الشرائح لاكتشاف النتائج المرجوة. قد تختلف الكمية المثلى بين أنواع الخلايا ، مع ثلاث شرائح تثبت أنها كافية لخلايا الغدد الصماء. ومع ذلك ، فمن المستحسن استخدام المزيد من الشرائح لضمان إمكانية الكشف بدلا من المخاطرة بفقدان المعلومات القيمة.
مثل أي طريقة أخرى ، فإن شرائح الأنسجة لها قيود يجب مراعاتها عند تفسير النتائج. قد يؤدي تطبيق التحفيز الذي يستهدف أنواعا معينة من الخلايا إلى تأثيرات على أنواع الخلايا الأخرى في الشريحة ، مما قد يؤدي إلى حلقات التغذية الراجعة. ومع ذلك ، من المهم أيضا دراستها ، وبالتالي يمكن أن تكون الاستجابات المقاسة أكثر تمثيلا للاستجابة الفسيولوجية. لاستهداف الخلايا الانتقائي ، يمكن استخدام البروتوكولات التقليدية في المختبر . الأهم من ذلك أن الخلايا العنيبية تحتوي على إنزيمات البنكرياس التي يمكنها تكسير البروتينات وهضم شريحة الأنسجة ، مما يؤدي إلى تدهور الخلايا في غضون ساعات. للحفاظ على الصلاحية ، يعد الاستخدام المتسق لمثبطات التربسين ضروريا عندما تكون الشرائح في حالة ثابتة ، على الرغم من أن تطبيقها قد يتداخل مع النقل الناجح للفيروسات المستخدمة لأغراض وضع العلامات.
بالمقارنة مع عزل الجزيرة ، يمكن أن يؤثر تباين المانحين وجودة الأنسجة على كل من كمية وصلاحية الشرائح التي تم الحصول عليها. قد يؤدي عدم كفاية الجدوى بعد التقطيع إلى عمر قصير ويعيق القدرة على استزراع الشرائح. علاوة على ذلك ، يمكن أن يختلف عدد الجزر بشكل كبير بين الجهات المانحة ، مما يجعل من الصعب تقدير محتوى الجزر قبل إجراء التجارب. وبالتالي ، فإن الاختيار الدقيق لمعايير قبول المانحين وتنفيذ طرق التطبيع المناسبة ، مثل النسبة المئوية لمحتوى الهرمون للإفراز أو تغيير الطيات إلى خط الأساس ، أمر بالغ الأهمية. للحصول على نتائج متسقة ، ينصح بتقييم صلاحية شريحة الأنسجة قبل التجربة. علاوة على ذلك ، يوصى بدمج محفزات التحكم ذات الصلة (على سبيل المثال ، KCl) في التجربة. في حالات تحليل الخلايا الفردية ، مثل التصوير ، يمكن تنفيذ فرز الخلايا مسبقا بناء على استجابتها لمحفزات التحكم هذه. على الرغم من التحديات المذكورة ، تقدم الشرائح زيادة قيمة لطرق البحث الحالية.
يمكن استخدام البروتوكول الموصوف كنقطة انطلاق للعديد من التطبيقات ، ويمكن التلاعب بشرائح البنكرياس ، وفحص الاستجابات بعد مجموعة متنوعة من المحفزات. كما نوجه القراء إلى العديد من الدراسات البحثية باستخدام شرائح البنكرياس الفأر أو الإنسان ، مما يوفر رؤى قيمة لأولئك الذين يخططون لتجاربهم. في المستقبل ، من الممكن أن يتم التحقيق في العلاجات المحتملة باستخدام شرائح البنكرياس أو أن آليات المرض قد يتم نمذجتها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إجراء هذا البحث بدعم من شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بداء السكري (nPOD; RRID: SCR_014641) ، وهو مشروع بحثي تعاوني لمرض السكري من النوع 1 مدعوم من JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) وصندوق Leona M. and Harry B. Helmsley الخيري (Grant # 2018PG-T1D053 ، G-2108-04793). المحتوى والآراء المعبر عنها هي مسؤولية المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهة النظر الرسمية ل nPOD. يتم سرد منظمات شراء الأعضاء (OPO) التي تشارك مع nPOD لتوفير موارد البحث في http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. ويعرب المؤلفون عن امتنانهم للمتبرعين وأسرهم على مساهمتهم القيمة. تم دعم هذا العمل من قبل جمعية السكري الأمريكية 4-22-PDFPM (J.K.P.) وصندوق Leona M. and Harry B. Helmsley الخيري (منحة 2015-PG-T1D-052).
Materials
| Alanine | Sigma | A7627 | amino acid |
| AlexaFluor 488 goat anti-guineapig | Invitrogen | A11073 | secondary antibody |
| AlexaFluor 546 goat anti-rat | Thermo Fisher | A11077 | secondary antibody |
| AlexaFluor 647 goat anti-mouse | Thermo Fisher | A21235 | secondary antibody |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | inhibitor |
| Arginine | Sigma | A5006 | amino acid |
| Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Calcium dye |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Calcium dye |
| Fluorescein diacetat | Sigma | F7378 | viability marker |
| Glucagon | Sigma | G2654 | primary antibody |
| Glucagon ELISA (human kit) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA for hormone detection |
| Glutamine | Sigma | G3126 | amino acid |
| Insulin | Dako | A-0546 | primary antibody |
| Insulin ELISA (human) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA for hormone detection |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| LSM 900 | Zeiss | confocal microscope | |
| Pancreas Slice Chamber | Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | slice chamber for perifucion |
| Pancreas Slice Chamber Extender Kit | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | slice chamber for perifucion |
| Pancreas Slice Chamber Perforated Plate | Biorep Technologies | PERI-PSC-PP | slice chamber for perifucion |
| Perifusion system with automated tray handling | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
| Propidium iodide | Life technologies | P1304MP | dead marker |
| Semi-automatic vibratome VT1200S | Leica | 14048142066 | |
| Somatostatin | Millipore | MAB354 | primary antibody |
References
- Abdelli, S., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Lyon, J., et al. Research-focused isolation of human islets from donors with and without diabetes at the alberta diabetes institute isletcore. Endocrinology. 157 (2), 560-569 (2016).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446 (5), 553-558 (2003).
- Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
- Marolt, U., et al. Calcium imaging in intact mouse acinar cells in acute pancreas tissue slices. PLoS One. 17 (6), 0268644 (2022).
- Stozer, A., et al. Confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices. J Vis Exp. (170), e62293 (2021).
- Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS One. 8 (1), e54638 (2013).
- Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released atp to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
- Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. Katp-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar atp. Mol Cell Endocrinol. 230 (1-2), 51-58 (2005).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Mol Metab. 6 (9), 943-957 (2017).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Rep. 31 (1), 107469 (2020).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of langerhans and acinar cell biology. Nat Protoc. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525 (2020).
- Campbell-Thompson, M., et al. Network for pancreatic organ donors with diabetes (npod): Developing a tissue biobank for type 1 diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 28 (7), 608-617 (2012).
- Kaddis, J. S., Pugliese, A., Atkinson, M. A. A run on the biobank: What have we learned about type 1 diabetes from the npod tissue repository. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 22 (4), 290-295 (2015).
- Pugliese, A., et al. New insight on human type 1 diabetes biology: Npod and npod-transplantation. Curr Diab Rep. 14 (10), 530 (2014).
- Pugliese, A., et al. The juvenile diabetes research foundation network for pancreatic organ donors with diabetes (npod) program: Goals, operational model and emerging findings. Pediatr Diabetes. 15 (1), 1-9 (2014).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. J Biol Chem. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nat Commun. 11 (1), 3265 (2020).
- Huber, M. K., et al. Observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices. J Vis Exp. (170), e62207 (2021).
- Panzer, J. K., Tamayo, A., Caicedo, A. Restoring glutamate receptor signaling in pancreatic alpha cells rescues glucagon responses in type 1 diabetes. Cell Rep. 41 (11), 111792 (2022).
- Mateus Goncalves, L., Almaca, J. Functional characterization of the human islet microvasculature using living pancreas slices. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 602519 (2020).
- Doke, M., et al. Dynamic scrna-seq of live human pancreatic slices reveals functional endocrine cell neogenesis through an intermediate ducto-acinar stage. Cell Metab. 35 (11), 1944-1960 (2023).
- Mateus Goncalves, L., et al. Pericyte dysfunction and impaired vasomotion are hallmarks of islets during the pathogenesis of type 1 diabetes. Cell Rep. 42 (8), 112913 (2023).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85 (7), 950-955 (2008).
- Hart, N. J., Powers, A. C. Use of human islets to understand islet biology and diabetes: Progress, challenges and suggestions. Diabetologia. 62 (2), 212-222 (2019).
- Henquin, J. C. The challenge of correctly reporting hormones content and secretion in isolated human islets. Mol Metab. 30, 230-239 (2019).
- Panzer, J. K., Caicedo, A. Protocol to generate and utilize pancreatic tissue slices to study endocrine and exocrine physiology in situ from mouse and human tissue. STAR Protoc. 4 (3), 102399 (2023).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34 (3), 826-827 (2002).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by tpc2-dependent ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic alpha-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), e78706 (2013).
- Gal, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Front Physiol. 10, 938 (2019).
