Denne protokol beskriver, hvordan man genererer menneskelige bugspytkirtelskiver fra afdøde organdonorer for at studere cellefunktion under næsten fysiologiske forhold. Denne innovative tilgang muliggør undersøgelse af normale og strukturelt beskadigede øer og det indviklede samspil mellem endokrine og eksokrine rum.
Det er afgørende at studere den menneskelige bugspytkirtel for at forstå de patofysiologiske mekanismer forbundet med type 1 (T1D) og 2 diabetes (T2D) samt bugspytkirtlen, endokrine og eksokrine fysiologi og samspil. Meget er blevet lært af undersøgelsen af isolerede bugspytkirteløer, men dette forhindrer undersøgelse af deres funktion og interaktioner i sammenhæng med hele vævet. Bugspytkirtelskiver giver en unik mulighed for at udforske fysiologien af normale, betændte og strukturelt beskadigede øer i deres oprindelige miljø, hvilket igen tillader undersøgelse af interaktioner mellem endokrine og eksokrine rum for bedre at undersøge den komplekse dynamik i bugspytkirtelvæv. Således repræsenterer vedtagelsen af den levende bugspytkirtelskiveplatform et betydeligt fremskridt på området. Denne protokol beskriver, hvordan man genererer levende vævsskiver fra afdøde organdonorer ved vævsindlejring i agarose- og vibratomskæring samt deres udnyttelse til at vurdere funktionelle aflæsninger såsom dynamisk sekretion og levende cellebilleddannelse.
Undersøgelser af øfysiologi er grundlæggende for at forstå patogenesen af diabetes og udvikle nye terapeutiske tilgange. Indtil videre har forskning været afhængig af isolerede øer, som udsætter øerne for mekaniske og enzymatiske belastninger, hvilket sandsynligvis forårsager ændringer i cellefysiologi; Desuden er det ikke muligt at evaluere øfunktionen i sammenhæng med deres naturlige vævsmiljø, som sandsynligvis påvirkes af eksokrine og vaskulære celler blandt andet1. Når man studerer bugspytkirtlen fra donorer med T1D, er der den udfordring, at deres øer er vanskelige at isolere og kan blive fragmenteret under isolationen, hvilket kan give en selektionseffekt på øer, der muligvis ikke repræsenterer befolkningen in vivo2. Desuden vil øer blive adskilt fra deres komplekse miljø og cellulære forbindelser, især fra de infiltrerende immunceller, der findes i betændte øer og er mere rigelige i øens periferi. Mens isolerede øer er et hjørnestensværktøj i diabetesforskning, er der således begrænsninger. Som svar introducerer vi en banebrydende protokol til generering af levende bugspytkirtelskiver, der tilbyder en løsning på disse udfordringer.
Den seneste udvikling og vedtagelse af pancreas væv slicing teknikker betragtes som et gennembrud for vores evne til at udforske den indviklede biologi og funktioner i bugspytkirtlen. Denne innovation har åbnet nye veje for dynamiske studier af øfysiologi og interaktioner mellem endokrine, eksokrine og neurale, vaskulære og immunceller inden for deres naturlige anatomiske kontekst. I modsætning til konventionelle tilgange bevarer denne in vitro-indstilling meget af organets cytoarkitektur, hvilket giver mulighed for en tættere tilnærmelse til dets oprindelige biologi. Denne metode, der oprindeligt blev udviklet i mus af Speier og Rupnik i 20033, har vist sin anvendelighed til at vurdere calciumbilleddannelse, elektrofysiologi og hormonsekretion til både intra- og intercellulær signalering 4,5,6,7,8,9. Skiveplatformen i bugspytkirtlen blev derefter anvendt til undersøgelse af humant bugspytkirtelvæv opnået via kirurgisk biopsi 4,10,11,12. Vores gruppe demonstrerede muligheden for at opnå og udnytte bugspytkirtelskiver fra kadaveriske organdonorer gennem aktiviteten i netværket for pancreas organdonorer med diabetes (nPOD)13. nPOD leverer bugspytkirtelvæv til godkendte efterforskere, der udfører forskning om human type 1-diabetes, og siden vedtagelsen af bugspytkirtelskiveplatformen genererer og distribuerer nPOD rutinemæssigt levende bugspytkirtelskiver 14,15,16,17. Siden implementeringen af bugspytkirtelskiveplatformen i 2020 har nPOD med succes distribueret vævsskiver fra 43 donorer (inklusive 12 donorer med T1D) til adskillige efterforskere. Ved hjælp af disse skiver udførte forskere banebrydende forskning om kritiske aspekter af øfunktion og udforskede samspillet mellem øer og vaskulaturen, nervesystemet og immuncellerne i forbindelse med T1D 13,18,19,20,21,22,23,24. Talrige undersøgelser har fremhævet begrænsningerne ved traditionelle tilgange og understreget betydningen af teknikker, der kan fange det dynamiske samspil i bugspytkirtlen 25,26,27. Tilpasningsevnen af udskæringsteknikker fra mus til menneskelig bugspytkirtel kombineret med deres integration i programmer som Network for Pancreas Organ Donors with Diabetes (nPOD) eksemplificerer den voksende anerkendelse af metodens potentiale til at låse op for værdifuld indsigt i sygdomme som type 1-diabetes.
Her præsenterer vi en protokol til generering af levedygtige bugspytkirtelvævsskiver og deres anvendelse til funktionelle aflæsninger som dynamisk hormonsekretion og funktionel billeddannelse. I lighed med isolering af human ø påvirkes skiveprocedurens succes af forskellige faktorer, herunder donoregenskaber, vævsforsendelsestid og vævskvalitet25,29. Derfor er det afgørende nøje at udvælge vævsprøver til forsøget og holde iskæmitiderne på et minimum. I den forbindelse bør andre potentielle kilder til humant væv ud over kadaveriske donorer overvejes nøje. Inkludering af kirurgiske donorer giver mulighed for at kombinere funktionelle skivedata med relevante in vivo-oplysninger fra den samme patient, hvilket styrker den translationelle relevans11. Denne vævskilde bringer imidlertid andre faktorer ind, da biopsier normalt er fra ældre patienter, der gennemgår pancreatectomy, hovedsagelig på grund af en lokaliseret tumor. Især udføres bugspytkirtelbiopsier ikke i forbindelse med diabetes.
Ved udførelse af den faktiske udskæringsprocedure er rettidig vævsbehandling kritisk. Skiver kan opbevares i flere timer, som beskrevet i denne protokol, eller dyrkes i længere perioder, som beskrevet af Qadir et al.19. På nuværende tidspunkt står denne protokol som den eneste metode til at opretholde skivens levedygtighed over længere varighed, men fremtidige bestræbelser bør vurdere funktionelle ændringer på tværs af forskellige kulturtider og drage sammenligninger med isolerede øer fra den samme donor.
Det mest kritiske trin i processen er omhyggelig vævsforberedelse inden indlejring i agarose. Store kanaler og fibrotisk væv kan komplicere udskæringsprocessen og potentielt føre til, at vævsblokke bryder ud af agarose. Hvis dette sker, og stykkerne forbliver rimelige størrelser, kan de oparbejdes og indlejres til udskæring. Opretholdelse af god vævskvalitet og omhyggelig behandling forbedrer i høj grad udskæringsprocedurens effektivitet og giver den maksimale mængde og kvalitet af skiver. Den tid, der går fra vævsforberedelse til skivegenerering, bør ikke overstige 2-3 timer, da længere intervaller påvirker vævets levedygtighed betydeligt.
Under skiveperifusion er et enkelt, men kritisk trin den præcise trimning af skiven for at sikre en perfekt pasform i kammeret. Dette giver mulighed for korrekt badning af vævet og uafbrudt strømning. Når protokollen er indledt, er det vigtigt at undgå yderligere manipulation af kamrene for at forhindre uønskede pigge i hormonfrigivelsen. Der skal forberedes tilstrækkelig buffer, og slangen skal nå opløsningens bund for at forhindre, at luftsugning og kamre løber tør.
For calciumbilleddannelse er det vigtigt at vælge interesseområdet omhyggeligt afhængigt af eksperimentelle behov og design. Det er vigtigt at minimere fotoblegning ved at vælge billeddannelsesparametre, der reducerer lyseksponeringen eller forkorter den samlede protokoltid. Ligesom dynamisk hormonsekretion er det afgørende at opretholde korrekt opløsningsflow og en opvarmet indstilling, da skiver kræver næsten fysiologiske forhold for optimal funktion (f.eks. 37 ° C).
Bugspytkirtelvævsskiver opretholder effektivt bugspytkirtlens strukturelle integritet og bevarer celle-celleforbindelser mellem dens forskellige celletyper. Derfor giver de et alternativ til at arbejde med isolerede holme, hvilket letter den samtidige udforskning af både endokrine og eksokrine funktioner og deres samspil. For at vurdere samspillet mellem de enkelte celletyper er det afgørende at skelne mellem dem. Farvning bagefter er en mulighed, men det har begrænsninger med hensyn til tilgængelige fluorescerende sonder og udfordringen med at lokalisere nøjagtige cellelag. Derfor er det tilrådeligt at inkorporere cellespecifikke stimuli i protokollen for at muliggøre cellediskrimination baseret på svar. For at skelne mellem celletyper i mus eller humane skiver inkluderer effektive stimuli adrenalin til alfaceller21,30, ghrelin til deltaceller31, cerulein til acinarceller 5,32, galdesyrer til duktalceller33 og noradrenalin til vaskulære celler22. Lignende stimuli kan anvendes til måling af sekretoriske reaktioner. Mens billeddannelsesundersøgelser fokuserer på individuelle celler, analyserer sekretionsundersøgelser det kollektive respons. Derfor er det afgørende at inkludere et rigeligt antal skiver for at opdage de ønskede resultater. Den optimale mængde kan variere mellem celletyper, hvor tre skiver viser sig tilstrækkelige til endokrine celler; Det er dog tilrådeligt at bruge flere udsnit for at sikre detekterbarhed i stedet for at risikere at gå glip af værdifuld information.
Som enhver anden metode har vævsskiver begrænsninger, der bør overvejes ved fortolkning af resultater. Stimulusapplikation rettet mod specifikke celletyper kan føre til virkninger på andre celletyper i skiven, hvilket potentielt udløser feedback-sløjfer. Disse er imidlertid også vigtige at studere, og derfor kan målte responser være mere repræsentative for et fysiologisk respons. Til selektiv cellemålretning kan traditionelle in vitro-protokoller anvendes. Det er vigtigt, at acinarceller indeholder bugspytkirtelenzymer, der kan nedbryde proteiner og fordøje vævsskiven, hvilket resulterer i cellulær nedbrydning inden for få timer. For at opretholde levedygtighed er den konsekvente anvendelse af trypsinhæmmere afgørende, når skiverne er i statisk tilstand, selvom deres anvendelse kan forstyrre den vellykkede overførsel af vira, der anvendes til mærkningsformål.
Sammenlignet med øisolering kan donorvariabilitet og vævskvalitet påvirke både mængden og levedygtigheden af de opnåede skiver. Utilstrækkelig levedygtighed efter udskæring kan resultere i en kort levetid og hindre evnen til at dyrke skiverne. Desuden kan øtællinger variere betydeligt blandt donorer, hvilket gør det udfordrende at estimere øindhold, før der udføres eksperimenter. Derfor er omhyggelig udvælgelse af donoracceptkriterier og implementering af passende normaliseringsmetoder, såsom procentdelen af hormonindhold til sekretion eller foldændring til baseline, afgørende. For konsistente resultater anbefales det at vurdere vævsskivens levedygtighed før eksperimentet. Desuden anbefales det at inkorporere relevante kontrolstimuli (f.eks. KCl) i eksperimentet. I tilfælde af individuel celleanalyse, såsom billeddannelse, kan forsortering af celler baseret på deres respons på disse kontrolstimuleringer implementeres. På trods af de nævnte udfordringer tilbyder skiver en værdifuld udvidelse af nuværende forskningsmetoder.
Den beskrevne protokol kan bruges som udgangspunkt for flere applikationer, og bugspytkirtelskiver kan manipuleres, og svar undersøges efter en række stimuli. Vi leder også læserne til adskillige forskningsundersøgelser, der bruger skiver fra mus eller menneskelig bugspytkirtel, hvilket giver værdifuld indsigt for dem, der planlægger deres eksperimenter. I fremtiden er det muligt, at potentielle terapier kan undersøges ved hjælp af bugspytkirtelskiver, eller at sygdomsmekanismer kan modelleres.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev udført med støtte fra netværket for pancreas organdonorer med diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), et forskningsprojekt om type 1-diabetes støttet af JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) og The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant#2018PG-T1D053, G-2108-04793). Det udtrykte indhold og synspunkter er forfatternes ansvar og afspejler ikke nødvendigvis nPODs officielle holdning. Organ Procurement Organizations (OPO), der samarbejder med nPOD om at levere forskningsressourcer, er opført på http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Forfatterne er taknemmelige over for donorerne og deres familier for deres uvurderlige bidrag. Dette arbejde blev støttet af American Diabetes Association 4-22-PDFPM (J.K.P.) og Leona M. og Harry B. Helmsley Charitable Trust (tilskud 2015-PG-T1D-052).
Alanine | Sigma | A7627 | amino acid |
AlexaFluor 488 goat anti-guineapig | Invitrogen | A11073 | secondary antibody |
AlexaFluor 546 goat anti-rat | Thermo Fisher | A11077 | secondary antibody |
AlexaFluor 647 goat anti-mouse | Thermo Fisher | A21235 | secondary antibody |
Aprotinin | Sigma | A1153 | inhibitor |
Arginine | Sigma | A5006 | amino acid |
Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Calcium dye |
Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Calcium dye |
Fluorescein diacetat | Sigma | F7378 | viability marker |
Glucagon | Sigma | G2654 | primary antibody |
Glucagon ELISA (human kit) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA for hormone detection |
Glutamine | Sigma | G3126 | amino acid |
Insulin | Dako | A-0546 | primary antibody |
Insulin ELISA (human) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA for hormone detection |
Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
LSM 900 | Zeiss | confocal microscope | |
Pancreas Slice Chamber | Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Extender Kit | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Perforated Plate | Biorep Technologies | PERI-PSC-PP | slice chamber for perifucion |
Perifusion system with automated tray handling | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
Propidium iodide | Life technologies | P1304MP | dead marker |
Semi-automatic vibratome VT1200S | Leica | 14048142066 | |
Somatostatin | Millipore | MAB354 | primary antibody |