여기에서는 쥐 쇄골 상부 갈색 지방 조직의 조직학적 및 유전자 발현 분석을 해부하고 수행하기 위한 실용적인 절차를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
갈색 지방 조직(BAT)에 의한 열발생은 신진대사 조절에 중요한 역할을 하며, 그 형태와 기능은 생쥐와 인간의 환경 자극에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다. 현재 쥐의 상부 등쪽 측면에 있는 두 개의 견갑골 사이에 위치한 쥐 견갑간 BAT(iBAT)는 BAT 기능을 연구하기 위해 연구 실험실에서 사용하는 주요 BAT 저장소입니다. 최근에는 이전에 알려지지 않았던 몇 개의 BAT 저장소가 마우스에서 확인되었는데, 그 중 하나는 인간의 쇄골 상부 갈색 지방 조직과 유사합니다. iBAT와 달리 쥐 쇄골 상 갈색 지방 조직(scBAT)은 목의 중간층에 위치하므로 쉽게 접근할 수 없습니다.
새로 확인된 마우스 scBAT의 연구를 용이하게 하기 위해, 출생 후 및 성체 마우스로부터 온전한 scBAT를 해부하는 단계를 상세히 기술하는 프로토콜이 본 명세서에 제시되어 있다. scBAT는 다른 지방 저장소에 비해 크기가 작기 때문에 scBAT 처리를 위해 절차가 수정되고 최적화되었습니다. 이러한 수정 사항 중에는 조직 수집 중에 해부 현미경을 사용하여 냉동 scBAT 샘플의 정밀도와 균질화를 증가시켜 후속 qPCR 분석의 효율성을 높이는 것이 있습니다. 이러한 최적화를 통해 마우스에서 scBAT의 식별, 형태학적 외관 및 분자 특성을 결정할 수 있습니다.
서론
미국과 전 세계적으로 비만의 유병률이 증가함에 따라 비만의 원인을 이해하고 잠재적인 치료법을 식별하는 데 큰 관심이 높아지고 있습니다 1,2. 지방 조직은 신진대사에 중요한 역할을 하며, 지방 조직의 조절 장애는 비만의 발병으로 이어질 수 있습니다. 일반적으로 지방 조직에는 흰색과 갈색 지방 조직의 두 가지 유형이 있습니다. 백색 지방 조직(WAT)은 화학 에너지를 저장하고 내분비 인자를 분비할 수 있는 반면, 갈색 지방 조직(BAT)은 화학 에너지를 사용하여 열을 발생시키고 추위 속에서 체온을 유지할 수 있습니다 3,4. 이러한 독특한 능력으로 인해 BAT의 활성화는 에너지 소비를 증가시키고 인슐린 감수성을 향상시킬 수 있다5.
BAT는 비(非)떨림 열발생(uncoupling protein 1, UCP1)6에 의해 매개되는 과정을 통해 기능을 발휘합니다. 생쥐와 인간을 포함한 포유류는 다양한 양의 BAT를 가지고 있습니다. BAT의 고전적 견해는 이....
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프로토콜
동물 시술은 베일러 의과대학(Baylor College of Medicine)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 모든 시술은 생후 3주 및 3개월 된 C57BL/6J 수컷 마우스에 대해 수행하였다. 해부에 앞서, 모든 쥐는 승인된 설치류 이산화탄소 안락사 절차를 사용하여 안락사시켰다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. scBAT 해부
- 쥐 사체를 작업대에 놓고 수술용 가위와 극세 포인트 집게를 70% 에탄올로 청소합니다.
- 쥐의 복부 목에 70% 에탄올을 뿌려 털을 적시고 털 오염을 최소화합니다.
- 쇄골을 따라 약 1.5cm의 양측 절개를 합니다.
- 이전 절개 끝에서 귀를 향해 세로로 약 1cm 길이로 자릅니다. 이렇게 하면 목 주위에 사각형 U자형 절개가 형성됩니다(그림 1A,B).
알림: scBAT는 목의 중간 층에 있습니다. 피부, 피하 지방 조직, 침샘으로 구성된 표층이 이 단계에서 노....
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결과
두 견갑골 사이의 등 피하층에 위치한 iBAT와 달리 scBAT는 목의 중간층에 위치하며 외경정맥을 따라 성장하면서 골격근과 타액선 층 사이 깊숙이 뻗어 있습니다(그림 1A). scBAT를 분석하는 것은 iBAT만큼 간단하지 않습니다. 여기에서는 출생 후 및 성체 마우스에서 온전한 scBAT를 해부하기 위한 중요한 단계를 포함한 자세한 절차를 제공합니다(그림 1B,C). 제공된 프로토콜을 사용하여 목을 연 후 해부 현미경으로 scBAT의 얇은 층을 식별하고 한 쌍의 겸자를 사용하여 연결된 타액선과 외부 경정맥에서 벗겨낼 수 있습니다(그림 1D,E). 저장소의 형태를 평가하기 위해, 새로 분리된 scBAT를 이전에 공개된 H&E 염색 절차(
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토론
이 프로토콜에서는 H&E 및 유전자 발현 분석을 위한 scBAT의 해부 및 처리 절차를 자세히 설명합니다. scBAT는 목의 중간층에 있고 큰 정맥을 따라 놓여 있기 때문에 이 저장소의 격리에는 정밀한 기술이 필요합니다. 특히, 창고를 명확하게 보려면 목을 연 후 해부 현미경 아래에 마우스를 놓는 것이 좋습니다. 한 쌍의 초미세 포인트 겸자를 사용하여 타액선과 주변 정맥에서 scBAT를 벗겨내고 정맥에 구멍이 뚫리지 않도록 주의해야 합니다. 출혈이 과도하면 scBAT를 찾기가 더 어려워질 수 있습니다. H&E 염색을 위한 scBAT를 처리하기 위해, 프로토콜 섹션에 표시된 바와 같이 조직 처리를 위해 4% PFA, 탈수제 알코올 및 유기 용매인 톨루엔을 사용하기 위해 약간의 수정을 가하여 공개된 프로토콜19 의 사용을 조정했습니다. 전체 절차를 완료하는 데 ~6일이 소요되며 H&E 염색 슬라이드는 염색 완료 후 다음날 이미지화할 수 있습니다.
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH의 NIDDK의 Award Number R01DK116899, USDA/ARS의 Award Number 3092-51000-064-000D, Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute의 파일럿 어워드의 지원을 받습니다. 순서도는 BioRender를 사용하여 제작되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 95% 탈수성 알코올(Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% 탈수성 알코올(Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96웰 PCR 플레이트 | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum 바인딩 미니 컬럼 | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Tightency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Tightency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| 베이스 몰드 (임베딩용) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| 캡리스 마이크로 원심분리기 튜브 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 저점도 장착 매체 | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| 해부 현미경 | Nikon | ||
| DNase 희석 용액 | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTP | Invitrogen | 18427013 | |
| 용리 용액 | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 임베딩 배지 파라핀 | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| 포뮬러 R 침투 매체 파라핀 | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec의 순수 에탄올 - 200 프루프 (70% 에탄올용) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' 씰(접착 씰) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| 분자 생물학 등급 물 | 코닝 | 46-000-CM | |
| 모르타르 Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl(0.85% 식염수용) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop 분광 광도계 | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| 파라핀 섹션 부유 Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| 파라포름알데히드(PFA) | 시그마-알드리치 | P6148-500G | |
| PCR 튜브 스트립 | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle, Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| 유봉 펠렛 모터 | Kimble | 749540-0000 | |
| 인산염 버퍼 식염수 (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| 정밀 모델 19 진공 오븐 | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| 프라이머: 36B4 (앞으로) 10 μ M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3' | 첸 랩 올리고 데이터베이스 | ||
| 입문서 : 36B4 (역) 10 μ M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3' | 첸 연구소 올리고 데이터베이스 | ||
| 입문서 : Fabp4 (앞으로) 10 μ M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3' | 첸 연구소 올리고 데이터베이스 | ||
| 입문서 : Fabp4 (역) 10 μ M 5' CCA TCT 애그리지 GTT ATG ATG CTC TTC A 3' | 첸 연구소 올리고 데이터베이스 | ||
| 입문서 : 글럿 4 (앞으로 프라이머) 10 μ M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3' | 첸 랩 올리고 데이터베이스 | ||
| 입문서 : 과분 4 (역) 10 μ M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3' | 첸 연구소 올리고 데이터베이스 | ||
| 입문서 : PPARg (앞으로) 10 μ M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3' | 첸 랩 올리고 데이터베이스 | ||
| 입문서 : PPARg (예비) 10 μ M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3' | 첸 랩 올리고 데이터베이스 | ||
| 입문서 : Ppargc1a (reverse) 10 μ M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3' | 첸 랩 올리고 데이터베이스 | ||
| 입문서 : Ppargc1a (앞으로) 10 μ M 5' ACG TCC CTG CTC 아가 GCT TCT CA 3' | 첸 랩 올리고 데이터베이스 | ||
| 입문서 : Ucp1 (앞으로) 10 μ M 5' AGC CAC CAC 아가 AAG CTT GTC AAC 3' | 첸 랩 올리고 데이터베이스 | ||
| 입문서 : Ucp1 (역) 10 μ M 5' 아카 GCT TGG 전술 GCT TGG GTA CTG 3' | Chen lab Oligo 데이터베이스 | ||
| RNA 분리 솔루션(PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away(표면 오염 제거) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase 억제제(RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| 섬광 바이알(유리) | 전자 현미경 Sciences | 72632 | |
| 슬라이드 건조 벤치 | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| 스테인레스 염색 랙 | 전자 현미경 과학 | 70312-54 | |
| 실체 현미경 (임베딩 용) | 올림푸스 | SZ51 | |
| Sugical 가위 | McKesson | 43-1-104 | |
| 초미세 포인트 스트레이트 해부 집게 | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III 역전사효소 (5x First-Strand 버퍼 및 0.1M DTT 포함) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET 주사기(바늘 포함) 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green(qPCR 효소 마스터 혼합물) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek 수동 슬라이드 염색 세트(용기) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| 전사 피펫 | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
참고문헌
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217(2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L.
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재인쇄 및 허가
