Driedimensionale celkweekmodellen om de epitheelbarrière bij eosinofiele oesofagitis te onderzoeken
Summary
Hier wordt een protocol verstrekt voor de cultuur van menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistof-interfacecultuur. De lucht-vloeistofinterfacecultuur van slokdarmorganoïden kan worden gebruikt om de impact van cytokines op de slokdarmepitheelbarrière te bestuderen.
Abstract
Het plaveiselepitheel van de slokdarm wordt direct blootgesteld aan de omgeving en wordt continu geconfronteerd met vreemde antigenen, waaronder voedselantigenen en microben. Het handhaven van de integriteit van de epitheelbarrière is van cruciaal belang voor het voorkomen van infecties en het voorkomen van ontstekingen veroorzaakt door onschadelijke van voedsel afgeleide antigenen. Dit artikel biedt vereenvoudigde protocollen voor het genereren van menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistofinterfaceculturen uit biopsieën van patiënten om het epitheelcompartiment van de slokdarm te bestuderen in de context van weefselhomeostase en ziekte. Deze protocollen zijn in het afgelopen decennium belangrijke wetenschappelijke mijlpalen geweest en beschrijven driedimensionale orgaanachtige structuren van van patiënten afgeleide primaire cellen, organoïden en lucht-vloeistofinterfaceculturen. Ze bieden de mogelijkheid om de functie van specifieke cytokines, groeifactoren en signaalroutes in het slokdarmepitheel te onderzoeken binnen een driedimensionaal kader met behoud van de fenotypische en genetische eigenschappen van de donor. Organoïden geven informatie over weefselmicroarchitectuur door het transcriptoom en proteoom na cytokinestimulatie te beoordelen. Lucht-vloeistof-interfaceculturen daarentegen maken de beoordeling van de integriteit van de epitheliale barrière mogelijk door middel van transepitheliale weerstand (TEER) of macromolecuulfluxmetingen. Het combineren van deze organoïden en lucht-vloeistof-interfaceculturen is een krachtig hulpmiddel om onderzoek naar verminderde slokdarmepitheliale barrièrecondities te bevorderen.
Introduction
Slokdarmontsteking brengt de integriteit van de epitheelbarrièrein gevaar 1,2,3,4,5, zoals waargenomen bij eosinofiele oesofagitis (EoE), een door Th2 gedomineerde chronische ontstekingsziekte van de slokdarm 6. EoE werd voor het eerst beschreven inde jaren 1990 7,8 en wordt voornamelijk geïnduceerd door voedselantigenen 9,10,11,12,13. De meest voorkomende symptomen van EoE bij de volwassen bevolking zijn dysfagie en voedselimpactie14. Bij kinderen manifesteert EoE zich meestal met groeiachterstand, voedselweigering, braken en buikpijn15. Genoomwijde associatiestudies (GWAS) hebben EoE-risicogenen geïdentificeerd die betrokken zijn bij de integriteit van de epitheliale barrière, waardoor het epitheel in de focus van EoE-onderzoek is komen te staan 16,17,18. EoE-transcriptomics toonden verder aan dat een verstoord differentiatieproces en een reactieve hyperplasie van de basale zone de aangetaste barrièrefunctie van het slokdarmepitheel veroorzaken 3,5,19,20,21,22. Het vroege begrip dat EoE een Th2-gemedieerde ziekte is6 leidde tot de ontdekking van IL-13 als een drijvende mediator door de epitheliale integriteit te verstoren 3,4,21,23. Experimentele systemen die het mogelijk maken om cytokine-gemedieerde effecten op de epitheelintegriteit te ontleden van intrinsieke barrièrestoornissen door genetische predispositie, bieden de mogelijkheid om het complexe samenspel tussen immuuncellen en het epitheel in EoE te bestuderen. Menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistof-interface (ALI)-culturen zijn voorgesteld als waardevolle hulpmiddelen om de gevolgen van cytokinestimulatie op de epitheelintegriteit te analyseren.
Het eerste protocol voor het genereren van van volwassen weefselspecifieke stamcellen (ASC) afgeleide slokdarmorganoïden werd vijf jaar na de eerste gepubliceerde rapporten van darmorganoïden in 2009 vastgesteld met behulp van intestinale Lgr5+ ASC’s die het epitheelcompartiment van de dunne darm recapituleerden24. DeWard et al. waren pioniers op het gebied van het genereren van organoïden uit slokdarmepitheelcellen van muizen25. In 2018 genereerden Kasagi et al. menselijke slokdarmorganoïden uit de onsterfelijke menselijke plaveiselepitheelcellijn EPC2-hTERT en primaire van patiënten afgeleide cellen26. In hetzelfde jaar genereerden Zhang et al. met succes geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide slokdarmorganoïden. Ze schetsten het belang van remming van TGFβ en botmorfogenetisch eiwit (BMP) voor de ontwikkeling van slokdarmvoorlopercellen (EPC) en de cruciale rol van Notch-signalering bij de differentiatie van het gestratificeerde plaveiselepitheel26,27. Trisno en collega’s vulden deze bevindingen aan door Sox2 te identificeren als een Wnt-remmer die het ontwikkelingslot richt op slokdarmdifferentiatie28. De daaropvolgende verfijningen van protocollen, mediumsamenstelling en kweekomstandigheden verhoogden de vormingssnelheid van organoïden en maakten subcultuur en herstel van organoïden na cryopreservatie mogelijk 26,29,30,31,32. Hoewel deze organoïden krachtige instrumenten zijn voor het bestuderen van weefselarchitectuur en expressie van potentiële doelgenen na stimulatie met cytokines, zullen slokdarmorganoïden niet de mogelijkheid bieden om transepitheliale weerstand (TEER) of macromolecuulflux te meten als directe metingen voor barrière-integriteit. Zoals eerder beschreven door Sherrill en collega’s22, maken ALI-culturen die epitheliale differentiatiemodelleren 4 directe beoordelingen van de epitheliale integriteit mogelijk. Het combineren van van patiënten afgeleide organoïden en ALI-culturen is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van weefselarchitectuur en integriteit van de epitheliale barrière in EoE.
Hier zijn procedures met instructies voor het isoleren van levensvatbare cellen uit slokdarmbiopsieën en het opzetten van slokdarmorganoïde- en ALI-culturen die verder kunnen worden gebruikt om de effecten van cytokinen op de integriteit van de barrière te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De aangeboden procedures maken het mogelijk om van patiënten afgeleide organoïden en ALI-culturen te kweken met een hoge kans op succes. Het organoïdenprotocol is aangepast van het eerste gepubliceerde protocol dat de generatie van menselijke slokdarmorganoïden rapporteert26 en van een recent gepubliceerd protocol32. Sherill en collega’s hebben het ALI-model22 beschreven. Organoïden en ALI-kweekmodellen helpen elkaar bij het bestuderen van de im…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De SNSF-subsidie 310030_219210 aan J.H.N. ondersteunde de publicatie van dit manuscript zonder beperkingen. Figuur 1 is tot stand gekomen met behulp van BioRender.com.
Materials
| 1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
References
- Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
- Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355 (2016).
- Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
- Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755 (2015).
- Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
- Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
- Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
- Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
- Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
- Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
- Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
- Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
- Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
- Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), 1022-1033 (2018).
- Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
- Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593 (2014).
- Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
- Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
- Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
- Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
- Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
- Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
- Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), 516-529 (2018).
- Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), 501-515 (2018).
- Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109 (2020).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106 (2020).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 33-40 (1983).
- Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
- Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
- Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), (2023).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
- Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
- Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
- Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416 (2020).
- Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736 (2018).
- Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773 (2020).
