Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70
Summary
פרוטוקול זה מדגים את פעילות המלווה של חלבון הלם חום 70 (Hsp70). תאי E. coli dnaK756 משמשים כמודל לבדיקה מכיוון שהם מכילים Hsp70 ילידי ולקוי תפקודית, מה שהופך אותם רגישים ללחץ חום. המבוא ההטרולוגי של Hsp70 פונקציונלי מציל את חוסר הצמיחה של התאים.
Abstract
חלבון הלם חום 70 (Hsp70) הוא חלבון שמור המאפשר קיפול של חלבונים אחרים בתוך התא, מה שהופך אותו למלווה מולקולרי. בעוד Hsp70 אינו חיוני עבור תאי E. coli הגדלים בתנאים רגילים, מלווה זה הופך להיות חיוני לצמיחה בטמפרטורות גבוהות. מאחר ש-Hsp70 שמור מאוד, אחת הדרכים לחקור את תפקוד המלווה של גנים מסוג Hsp70 ממינים שונים היא לבטא אותם באופן הטרולוגי בזני E. coli שחסרים ב-Hsp70 או לבטא Hsp70 מקורי שנפגע מבחינה תפקודית. תאי E. coli dnaK756 אינם מסוגלים לתמוך בדנ”א של λ בקטריופאג’. יתר על כן, Hsp70 (DnaK) המקומי שלהם מציג פעילות ATPase מוגברת תוך הפגנת זיקה מופחתת ל- GrpE (גורם חילופי נוקלאוטידים Hsp70). כתוצאה מכך, תאי E. coli dnaK756 גדלים כראוי בטמפרטורות הנעות בין 30 °C (75 °F) ל 37 °C (75 °F), אך הם מתים בטמפרטורות גבוהות (>40 °C). מסיבה זו, תאים אלה משמשים מודל לחקר פעילות המלווה של Hsp70. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליישום תאים אלה לביצוע בדיקת השלמה, המאפשרת לחקור את פונקציית מלווה הצלולו של Hsp70.
Introduction
חלבוני הלם חום ממלאים תפקיד חשוב כמלווים מולקולריים בכך שהם מסייעים לקיפול חלבונים, מונעים צבירת חלבונים והופכים קיפול שגוישל חלבונים 1,2. חלבון הלם חום 70 (Hsp70) הוא אחד המלווים המולקולריים הבולטים ביותר, הממלא תפקיד מרכזי בהומאוסטזיס של חלבון 3,4. DnaK הוא E. coli Hsp70 homologue5.
בדיקות ביופיזיקליות, ביוכימיות ומבוססות תאים שונות פותחו כדי לחקור את פעילות המלווה של Hsp70 ולסנן מעכבים המכוונים למלווה זה 6,7,8. Hsp70 הוא חלבון שמור מאוד. מסיבה זו, מספר Hsp70s של אורגניזמים אאוקריוטים, כגון פלסמודיום falciparum (הסוכן העיקרי של מלריה), דווחו כתחליף לתפקוד DnaK ב- E. coli 6,9. בדרך זו, פותחה בדיקת השלמה מבוססת E. coli הכוללת את הביטוי ההטרולוגי של Hsp70s ב- E. coli כדי לחקור את הפונקציה cytoprotective שלהם. בדרך כלל, בדיקה זו כוללת ניצול של תאי E. coli אשר חסרים עבור DnaK או המבטאים DnaK מקורי כי הוא בסכנה תפקודית. בעוד DnaK אינו חיוני לצמיחת E. coli בתנאים רגילים, הוא הופך להיות חיוני כאשר התאים גדלים בתנאים מלחיצים כגון טמפרטורות גבוהות או צורות אחרות של מתח10,11.
זני E. coli שפותחו כדי לחקור את תפקוד Hsp70 באמצעות בדיקת השלמה כוללים E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) ו– E. coli dnaK756. תאי E. coli dnaK103 מייצרים DnaK קטוע שאינו מתפקד, וככזה, התאים גדלים כראוי ב 30 ° C, בעוד הזן רגיש לקור ומתח חום12,13. באופן דומה, זן E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) אינו גדל מעל 40°C14,15. זן E. coli dnaK756 מבטא DnaK טבעי מוטנטי (DnaK756) המאופיין בשלושה תחליפי גליצין לאספרטט במיקומים 32, 455 ו-468, מה שגורם לתוצאות פרוטאוסטטיות בסיכון. כתוצאה מכך, זן זה עמיד בפני בקטריופאג’ λ DNA14. בנוסף, E. coli dnaK756 מציג פעילות ATPase מוגברת, בעוד זיקתו לגורם חילופי הנוקלאוטידים, GrpE, מופחתת16. אי קולי זנים מוטנטיים של DnaK משמשים כמודלים אידיאליים לחקר פעילות המלווה של Hsp70 באמצעות גישת השלמה. מאחר ש-DnaK חיוני רק בתנאי לחץ, בדיקת ההשלמה מתבצעת בדרך כלל בטמפרטורות גבוהות (איור 1). כמה יתרונות של שימוש E. coli עבור מחקר זה כוללים גנום מאופיין היטב, צמיחה מהירה, ואת העלות הנמוכה של גידול ותחזוקה17.
במאמר זה, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול הכולל שימוש בתאי E. coli dnaK756 כדי לחקור את הפונקציה של Hsp70. ה-Hsp70s בהם השתמשנו בבדיקה הם מסוג פרא DnaK והנגזרת הכימרית שלו, KPf (המורכבת מתחום ATPase של DnaK המאוחה לתחום קשירת המצע C-terminal של Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F התבטא באופן הטרולוגי כבקרה שלילית, שכן המוטציה למעשה חוסמת אותו ממצע קשירה, ובכך מבטלת את פעילות המלווה שלו9.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול מדגים את התועלת של תאי E. coli dnaK756בחקר תפקוד המלווה של Hsp70 מבוטא באופן הטרולוגי. בדיקה זו יכולה להיות מאומצת כדי לסנן מעכבים המכוונים לתפקוד Hsp70 בצלולו. עם זאת, מגבלה אחת של שיטה זו היא כי Hsp70s שאינם מסוגלים להחליף DnaK ב E. coli אינם תואמים לבדיקה זו. חוסר שינוי לאחר תרגום<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה באמצעות מענק שהתקבל מהמרכז הבינלאומי להנדסה גנטית וביוטכנולוגיה (ICGEB), HDI/CRP/012, מנהל המחקר של אוניברסיטת ונדה, מענק I595, המחלקה למדע וחדשנות (DSI) וקרן המחקר הלאומית (NRF) של דרום אפריקה (מספרי מענקים, 75464 ו-92598) שהוענקו ל-AS.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. , (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).
- Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007)
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
