熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ
Summary
このプロトコルは熱衝撃蛋白質70 (Hsp70)のシャペロンの活動を示す。 大腸菌dnaK756 細胞は、天然の機能障害Hsp70を保有し、熱ストレスの影響を受けやすいため、アッセイのモデルとなります。機能的なHsp70の異種導入は、細胞の成長欠乏を救います。
Abstract
ヒートショックプロテイン70(Hsp70)は、細胞内の他のタンパク質のフォールディングを促進する保存されたタンパク質であり、分子シャペロンになります。Hsp70は、通常の条件下で増殖する 大腸菌 細胞には必須ではありませんが、高温での増殖にはこのシャペロンが不可欠です。Hsp70は高度に保存されているため、様々な種の Hsp70遺伝子のシャペロン機能を研究する1つの方法は、Hsp70が欠損している大腸菌株または機能的に損なわれた天然のHsp70を発現している大 腸菌 株でそれらを異種的に発現させることです。 大腸菌dnaK756細胞はλバクテリオファージDNAを支持できません。さらに、天然のHsp70(DnaK)は、GrpE(Hsp70ヌクレオチド交換因子)に対する親和性が低下する一方で、ATPアーゼ活性の上昇を示します。その結果、 大腸菌dnaK756細胞は30°Cから37°Cの範囲の温度で十分に増殖しますが、高温(>40°C)では死滅します。このため、これらの細胞はHsp70のシャペロン活性を研究するためのモデルとして機能します。ここでは、これらの細胞を相補アッセイに適用し、Hsp70の セルロシャ ペロン機能の研究を可能にする詳細なプロトコルについて説明します。
Introduction
熱ショックタンパク質は、タンパク質のフォールディングを促進し、タンパク質の凝集を防ぎ、タンパク質のミスフォールディングを逆転させることにより、分子シャペロンとして重要な役割を果たします1,2。熱ショックプロテイン70(Hsp70)は、タンパク質の恒常性において中心的な役割を果たす、最も著名な分子シャペロンの一つである3,4。DnaKは大腸菌Hsp70の相同体5である。
Hsp70のシャペロン活性を探り、このシャペロンを標的とする阻害剤をスクリーニングするために、さまざまな生物物理学的、生化学的、および細胞ベースのアッセイが開発されています6,7,8。Hsp70は高度に保存されたタンパク質です。このため、熱帯熱マラリア原虫(マラリアの主媒)などの真核生物のHsp70が、大腸菌のDnaK機能を代替することが報告されています6,9。このようにして、大腸菌におけるHsp70の異種発現を含む大腸菌ベースの相補アッセイが開発され、その細胞保護機能が探索されました。典型的には、このアッセイでは、DnaKが欠損している、または機能的に損なわれている天然DnaKを発現する大腸菌細胞の利用を伴います。DnaKは、通常の条件下では大腸菌の増殖に必須ではありませんが、細胞が高温やその他の形態のストレスなどのストレスの多い条件下で増殖すると不可欠になります10,11。
相補アッセイを用いてHsp70の機能を研究するために開発された大腸菌株には、大腸菌dnaK103(BB2393 [C600 dnaK103(Am)thr::Tn10])および大腸菌dnaK756が含まれます。大腸菌dnaK103細胞は、機能しない切断型DnaKを産生するため、細胞は30°Cで十分に増殖するが、菌株は寒さや熱ストレスに敏感である12,13。同様に、大腸菌dnaK756 / BB2362(dnaK756 recA :: TcR Pdm1,1)株は40°C以上では増殖しません14,15。大腸菌dnaK756株は、32位、455位、および468位で3つのグリシンからアスパラギン酸への置換を特徴とする変異体ネイティブDnaK(DnaK756)を発現し、タンパク質抑制の結果が損なわれます。その結果、この菌株はバクテリオファージλDNAに耐性である14。さらに、大腸菌dnaK756はATPアーゼ活性の上昇を示すが、ヌクレオチド交換因子であるGrpEに対する親和性は低下する16。大腸菌DnaK変異株は、相補的アプローチによってHsp70のシャペロン活性を調べるための理想的なモデルとなります。DnaKはストレスの多い条件下でのみ必須であるため、相補アッセイは通常、高温で実施されます(図1)。この研究に大腸菌を使用する利点には、そのよく特徴付けられたゲノム、急速な成長、および培養と維持の低コストが含まれます17。
この記事では、Hsp70の機能を研究するために大腸菌dnaK756細胞を使用するプロトコルについて詳しく説明します。今回使用したHsp70は、野生型DnaKとそのキメラ誘導体KPf(熱帯熱マラリア原虫Hsp70-1のC末端基質結合ドメインにDnaKのATPaseドメインが融合したもの)である6,18。KPf-V436Fは、変異が基質への結合を本質的にブロックし、シャペロン活性を阻害するため、ネガティブコントロールとして異種的に発現した9。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルは異種に表現されたHsp70のシャペロン機能の調査の エシェリヒア属大腸菌dnaK756セルの有用性を示す。このアッセイは、 セルロのHsp70機能を標的とする阻害剤のスクリーニングに採用できます。ただし、この方法の1つの制限は、 大腸菌 のDnaKを代替できないHsp70がこのアッセイに適合しないことです。一部の非天然Hsp70の翻訳後修飾21の欠如は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国際遺伝子工学バイオテクノロジーセンター(ICGEB)の助成金番号(HDI/CRP/012)、ヴェンダ大学研究局、科学イノベーション省(DSI)の助成金I595、南アフリカ国立研究財団(NRF)(助成金番号75464および92598)からASに授与された助成金によって支援されました。
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
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