Escherichia coli -basert komplementeringsanalyse for å studere chaperone-funksjonen til varmesjokkprotein 70
Summary
Denne protokollen demonstrerer chaperoneaktiviteten til varmesjokkprotein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-celler tjener som en modell for analysen da de har en innfødt, funksjonshemmet Hsp70, noe som gjør dem utsatt for varmestress. Den heterologe introduksjonen av funksjonell Hsp70 redder vekstmangelen til cellene.
Abstract
Varmesjokkprotein 70 (Hsp70) er et konservert protein som letter foldingen av andre proteiner i cellen, noe som gjør det til en molekylær chaperone. Mens Hsp70 ikke er avgjørende for E. coli-celler som vokser under normale forhold, blir denne chaperone uunnværlig for vekst ved forhøyede temperaturer. Siden Hsp70 er svært konservert, er en måte å studere chaperone-funksjonen til Hsp70-gener fra forskjellige arter å heterologisk uttrykke dem i E. coli-stammer som enten er mangelfulle i Hsp70 eller uttrykker en innfødt Hsp70 som er funksjonelt kompromittert. E. coli dnaK756 celler er ikke i stand til å støtte λ bakteriofag DNA. Videre viser deres opprinnelige Hsp70 (DnaK) forhøyet ATPase-aktivitet mens de demonstrerer redusert affinitet for GrpE (Hsp70 nukleotidutvekslingsfaktor). Som et resultat vokser E. coli dnaK756-celler tilstrekkelig ved temperaturer fra 30 ° C til 37 ° C, men de dør ved forhøyede temperaturer (>40 ° C). Av denne grunn tjener disse cellene som en modell for å studere chaperonaktiviteten til Hsp70. Her beskriver vi en detaljert protokoll for anvendelse av disse cellene for å utføre en komplementeringsanalyse, noe som muliggjør studiet av cellulo-chaperonfunksjonen til Hsp70.
Introduction
Varmesjokkproteiner spiller en viktig rolle som molekylære chaperoner ved å lette proteinfolding, forhindre proteinaggregering og reversere proteinfolding 1,2. Varmesjokkprotein 70 (Hsp70) er en av de mest fremtredende molekylære chaperonene, og spiller en sentral rolle i proteinhomeostase 3,4. DnaK er E. coli Hsp70 homolog5.
Ulike biofysiske, biokjemiske og cellebaserte analyser er utviklet for å utforske chaperonaktiviteten til Hsp70 og for å skjerme for hemmere rettet mot denne chaperone 6,7,8. Hsp70 er et svært konservert protein. Av denne grunn har flere Hsp70-er av eukaryote organismer, som Plasmodium falciparum (hovedmidlet til malaria), blitt rapportert å erstatte DnaK-funksjonen i E. coli 6,9. På denne måten har en E. coli-basert komplementeringsanalyse blitt utviklet som involverer det heterologe uttrykket av Hsp70s i E. coli for å utforske deres cytoprotektive funksjon. Vanligvis innebærer denne analysen bruk av E. coli-celler som enten er mangelfull for DnaK eller som uttrykker en innfødt DnaK som er funksjonelt kompromittert. Mens DnaK ikke er avgjørende for E. coli-vekst under normale forhold, blir det viktig når cellene dyrkes under stressende forhold som forhøyede temperaturer eller andre former for stress10,11.
E. coli-stammer som er utviklet for å studere Hsp70-funksjonen ved hjelp av en komplementeringsanalyse, inkluderer E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103 (Am) thr:: Tn10]) og E. coli dnaK756. E. coli dnaK103-celler produserer en avkortet DnaK som ikke er funksjonell, og som sådan vokser cellene tilstrekkelig ved 30 °C, mens belastningen er følsom for kulde og varmespenning 12,13. På samme måte vokser ikke E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1)-stammen over 40 °C14,15. E. coli dnaK756-stammen uttrykker en mutant innfødt DnaK (DnaK756) karakterisert ved tre glycin-til-aspartat-substitusjoner i posisjonene 32, 455 og 468, noe som gir opphav til kompromitterte proteostatiske utfall. Følgelig er denne stammen resistent mot bakteriofag λ DNA14. I tillegg viser E. coli dnaK756 forhøyet ATPase-aktivitet, mens affiniteten til nukleotidutvekslingsfaktoren, GrpE, reduseres16. E. coli DnaK-mutantstammer fungerer som ideelle modeller for å undersøke chaperonaktiviteten til Hsp70 gjennom en komplementeringstilnærming. Siden DnaK bare er essensielt under stressende forhold, utføres komplementeringsanalysen vanligvis ved forhøyede temperaturer (figur 1). Noen fordeler med å bruke E. coli for denne studien inkluderer det velkarakteriserte genomet, rask vekst og de lave kostnadene ved dyrking og vedlikehold17.
I denne artikkelen beskriver vi i detalj en protokoll som involverer bruk av E. coli dnaK756-celler for å studere funksjonen til Hsp70. Hsp70-ene vi benyttet i analysen er villtype DnaK og dets kimære derivat, KPf (består av ATPase-domenet til DnaK smeltet sammen med det C-terminale substratbindende domenet til Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F ble heterologisk uttrykt som en negativ kontroll siden mutasjonen i hovedsak blokkerer den fra bindende substrater, og dermed opphever sin chaperoneaktivitet9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen demonstrerer nytten av E. coli dnaK756-celleri å utforske chaperone-funksjonen til heterologisk uttrykt Hsp70. Denne analysen kan brukes til screenhemmere rettet mot Hsp70-funksjonen i cellulo. Imidlertid er en begrensning av denne metoden at Hsp70s ikke kan erstatte DnaK i E. coli ikke er kompatible med denne analysen. Mangel på posttranslasjonell modifikasjon21 av noen ikke-innfødte Hsp70s kan forklare deres mangel på funksjon innenfor E. coli-syste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet med tilskuddsmidler hentet fra International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) grant number, HDI/CRP/012, Research Directorate ved University of Venda, grant I595, Department of Science and Innovation (DSI) og National Research Foundation (NRF) i Sør-Afrika (grant numbers, 75464 &; 92598) tildelt AS.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. , (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).
- Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007)
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
