Isı Şoku Proteininin Şaperon Fonksiyonunu İncelemek için Escherichia coli Bazlı Tamamlama Testi 70
Summary
Bu protokol, ısı şoku proteini 70’in (Hsp70) şaperon aktivitesini gösterir. E. coli dnaK756 hücreleri, doğal, işlevsel olarak bozulmuş bir Hsp70 barındırdıkları için test için bir model görevi görür ve bu da onları ısı stresine duyarlı hale getirir. Fonksiyonel Hsp70’in heterolog girişi, hücrelerin büyüme eksikliğini kurtarır.
Abstract
Isı şoku proteini 70 (Hsp70), hücre içindeki diğer proteinlerin katlanmasını kolaylaştıran ve onu moleküler bir şaperon yapan korunmuş bir proteindir. Hsp70, normal koşullar altında büyüyen E. coli hücreleri için gerekli olmasa da, bu şaperon yüksek sıcaklıklarda büyüme için vazgeçilmez hale gelir. Hsp70 yüksek oranda korunduğundan, çeşitli türlerden Hsp70 genlerinin şaperon fonksiyonunu incelemenin bir yolu, onları Hsp70’te eksik olan veya işlevsel olarak tehlikeye atılmış doğal bir Hsp70’i eksprese eden E. coli suşlarında heterolog olarak ifade etmektir. E. coli dnaK756 hücreleri, λ bakteriyofaj DNA’sını destekleyemez. Ayrıca, doğal Hsp70 (DnaK), GrpE (Hsp70 nükleotid değişim faktörü) için azalmış afinite gösterirken yüksek ATPaz aktivitesi sergiler. Sonuç olarak, E. coli dnaK756 hücreleri, 30 °C ila 37 °C arasında değişen sıcaklıklarda yeterince büyür, ancak yüksek sıcaklıklarda (>40 °C) ölürler. Bu nedenle, bu hücreler Hsp70’in şaperon aktivitesini incelemek için bir model görevi görür. Burada, Hsp70’in selülo şaperon fonksiyonunun incelenmesini sağlayan bir tamamlama testi yapmak için bu hücrelerin uygulanması için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.
Introduction
Isı şoku proteinleri, protein katlanmasını kolaylaştırarak, protein agregasyonunu önleyerek ve protein yanlış katlanmasını tersine çevirerek moleküler şaperonlar olarak önemli bir rol oynar 1,2. Isı şoku proteini 70 (Hsp70), protein homeostazında merkezi bir rol oynayan en önemli moleküler şaperonlardan biridir 3,4. DnaK, E. coli Hsp70 homologu5’tir.
Hsp70’in şaperon aktivitesini araştırmak ve bu şaperon 6,7,8’i hedefleyen inhibitörleri taramak için çeşitli biyofiziksel, biyokimyasal ve hücre bazlı testler geliştirilmiştir. Hsp70 yüksek oranda korunmuş bir proteindir. Bu nedenle, Plasmodium falciparum (sıtmanın ana ajanı) gibi ökaryotik organizmaların birkaç Hsp70’inin, E. coli 6,9’da DnaK fonksiyonunun yerini aldığı bildirilmiştir. Bu şekilde, sitoprotektif fonksiyonlarını araştırmak için E. coli’de Hsp70’lerin heterolog ekspresyonunu içeren bir E. coli bazlı kompleman testi geliştirilmiştir. Tipik olarak, bu tahlil, DnaK için eksik olan veya işlevsel olarak tehlikeye atılmış doğal bir DnaK’yi eksprese eden E. coli hücrelerinin kullanımını içerir. DnaK, normal koşullar altında E. coli büyümesi için gerekli olmasa da, hücreler yüksek sıcaklıklar veya diğer stres biçimleri gibi stresli koşullar altında büyütüldüğünde gerekli hale gelir10,11.
Bir tamamlama testi kullanarak Hsp70 fonksiyonunu incelemek için geliştirilen E. coli suşları arasında E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103 () thr::Tn10]) ve E. coli dnaK756 bulunur. E. coli dnaK103 hücreleri, işlevsel olmayan kesilmiş bir DnaK üretir ve bu nedenle, hücreler 30 °C’de yeterince büyürken, suş soğuğa ve sıcak stresineduyarlıdır 12,13. Benzer şekilde, E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) suşu 40 °C’nin üzerinde büyümez14,15. E. coli dnaK756 suşu, 32, 455 ve 468 pozisyonlarında üç glisin-aspartat ikamesi ile karakterize edilen ve tehlikeye atılmış proteostatik sonuçlara yol açan mutant bir doğal DnaK’yi (DnaK756) eksprese eder. Sonuç olarak, bu suş bakteriyofaj λ DNA14’e dirençlidir. Ek olarak, E. coli dnaK756, yüksek ATPaz aktivitesi sergilerken, nükleotid değişim faktörü GrpE’ye olan afinitesi azalır16. E. coli DnaK mutant suşları, bir tamamlama yaklaşımı ile Hsp70’in şaperon aktivitesini araştırmak için ideal modeller olarak hizmet eder. DnaK sadece stresli koşullar altında gerekli olduğundan, tamamlama testi tipik olarak yüksek sıcaklıklarda gerçekleştirilir (Şekil 1). Bu çalışma için E. coli kullanmanın bazı avantajları arasında iyi karakterize edilmiş genomu, hızlı büyümesi ve düşük kültür ve bakım maliyetiyer alır 17.
Bu yazıda, Hsp70’in işlevini incelemek için E. coli dnaK756 hücrelerinin kullanımını içeren bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Testte kullandığımız Hsp70’ler, vahşi tip DnaK ve onun kimerik türevi KPf’dir (Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18’in C-terminal substrat bağlama alanına kaynaşmış DnaK’nin ATPaz alanından oluşur). KPf-V436F, heterolog olarak negatif bir kontrol olarak ifade edildi, çünkü mutasyon esasen onu substratların bağlanmasını bloke eder, böylece şaperon aktivitesini iptal eder9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol, heterolog olarak eksprese edilen Hsp70’in şaperon fonksiyonunu araştırmada E. coli dnaK756hücrelerinin faydasını göstermektedir. Bu test, selülde Hsp70 fonksiyonunu hedefleyen inhibitörleri taramak için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemin bir sınırlaması, E. coli’de DnaK’nin yerini alamayan Hsp70’lerin bu testle uyumlu olmamasıdır. Bazı doğal olmayan Hsp70’lerin translasyon sonrası modifikasyon21 eksikliği, E. coli sistem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Uluslararası Genetik Mühendisliği ve Biyoteknoloji Merkezi (ICGEB) hibe numarası, HDI/CRP/012, Venda Üniversitesi Araştırma Direktörlüğü, hibe I595, Bilim ve Yenilik Bölümü (DSI) ve Güney Afrika Ulusal Araştırma Vakfı’ndan (NRF) (hibe numaraları, 75464 ve 92598) elde edilen hibe fonu ile desteklenmiştir.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. , (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).
- Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007)
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
