Tillverkning av decellulariserad mjältmatris härledd från råttor
Summary
Den decellulariserade mjältmatrisen (DSM) har lovande tillämpningar inom området levervävnadsteknik. Detta protokoll beskriver proceduren för att förbereda DSM på råtta, vilket inkluderar skörd av råttmjälte, decellularisering av dem genom perfusion och utvärdering av den resulterande DSM för att bekräfta dess egenskaper.
Abstract
Levertransplantation är den primära behandlingen för leversjukdom i slutstadiet. Bristen på donerade organ och den otillräckliga kvaliteten på dem gör det dock nödvändigt att utveckla alternativa behandlingar. Bioartificiella lever (BALs) som använder decellulariserad levermatris (DLM) har dykt upp som lovande lösningar. Det är dock fortfarande en utmaning att hitta lämpliga DLM:er. Användningen av en decellulariserad mjältmatris (DSM) har utforskats som en grund för BALs, vilket erbjuder ett lättillgängligt alternativ. I denna studie skördades och decellulariserades råttmjälte med hjälp av en kombination av frys-upptiningscykler och perfusion med decellulariseringsreagenser. Protokollet bevarade mikrostrukturerna och komponenterna i den extracellulära matrisen (ECM) inom DSM. Den fullständiga decellulariseringsprocessen tog cirka 11 timmar, vilket resulterade i en intakt ECM inom DSM. Histologisk analys bekräftade avlägsnandet av cellulära komponenter samtidigt som ECM:s struktur och sammansättning bibehölls. Det presenterade protokollet ger en omfattande metod för att erhålla DSM, vilket erbjuder potentiella tillämpningar inom levervävnadsteknik och cellterapi. Dessa fynd bidrar till utvecklingen av alternativa metoder för behandling av leversjukdom i slutstadiet.
Introduction
Levertransplantation är fortfarande den enda definitiva behandlingen för leversjukdom i slutstadiet 1,2,3. Den kritiska bristen och den sjunkande kvaliteten på donerade organ har dock ökat behovet av alternativa behandlingar4. Inom regenerativ medicin har bioartificiella lever (BAL) som använder decellulariserad levermatris (DLM) dykt upp som lovande lösningar 5,6,7. DLM bevarar den ursprungliga leverstrukturen, inklusive dess intrikata mikrovaskulära nätverk och komponenter i ECM, och erbjuder en ställning för att skapa transplanterbara BAL:er som potentiellt kan lindra leversjukdomar.
Trots löftet står införandet av denna teknik inför utmaningar, särskilt när det gäller att hitta lämpliga DLM:er. DLM:er som härrör från människor är en bristvara, medan de från animaliska källor medför risker för sjukdomsöverföring och immunavstötning. I ett innovativt tillvägagångssätt har vår forskning utforskat användningen av en decellulariserad mjältmatris (DSM) som grund för BALs 8,9,10,11. Mjälte är mer lättillgängligt i olika medicinska situationer, såsom portal hypertoni, traumatisk ruptur, idiopatisk trombocytopen purpura och donation efter hjärtdöd. Därför är mjälte mer allmänt tillgänglig än lever för forskningsändamål. Patienter som har genomgått splenektomi lider inte av allvarliga tillstånd, vilket ytterligare bekräftar att mjälten är överflödig. Mjältens mikromiljö, särskilt den extracellulära matrisen och sinusformerna, liknar den i levern. Detta gör mjälten till ett lämpligt organ för celladhesion och proliferation i forskning om hepatocyttransplantation. Baserat på dessa resultat har våra tidigare undersökningar visat att DSM delar jämförbara mikrostrukturer och komponenter med DLM och kan stödja överlevnad och funktion av hepatocyter, inklusive albumin- och ureaproduktion. Dessutom har DSM visat sig förbättra den hepatiska differentieringen av benmärgens mesenkymala stamceller, vilket leder till förbättrad och konsekvent funktionalitet.
Genom att använda DSM behandlade med heparin har vi konstruerat funktionella BAL:er som kan uppvisa effektiv kortvarig antikoagulation och partiell leverfunktionskompensation11. Följaktligen är denna tredimensionella DSM mycket lovande för utvecklingen av levervävnadsteknik och cellterapi. I detta arbete presenterar vi detaljerade metoder för att skörda råttmjälte och förbereda DSM som bevarar mikrostrukturerna och komponenterna i ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
BAL:erna utgör ett effektivt tillvägagångssätt för behandling av leversjukdom i slutstadiet, särskilt i de fall där levertransplantation hindras av den nuvarande bristen på doneradeorgan. Ett lovande alternativ för att skapa BAL är användningen av DLM, som bevarar den naturliga leverns naturliga ECM och vaskulära struktur. Bristen på DLM hos människor och de potentiella riskerna för infektion och immunogenicitet i samband med DLM hos djur utgör dock betydande begränsningar. För a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82000624), Natural Science Basic Research Program of Shaanxi (2022JQ-899 & 2021JM-268), Shaanxi Province Innovation Capability Support Program (2023KJXX-030), Shaanxi Province Key R&D Plan University Joint Project-Key Project (2021GXLH-Z-047), Institutional Foundation of The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (2021HL-42 & 2021HL-21).
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
References
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, &. #. 2. 1. 4. ;. Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
