Dette manuskript beskriver en detaljeret protokol til generering og oprensning af adeno-associerede virale vektorer ved hjælp af en optimeret heparinbaseret affinitetskromatografimetode. Det præsenterer en enkel, skalerbar og omkostningseffektiv tilgang, hvilket eliminerer behovet for ultracentrifugering. De resulterende vektorer udviser høj renhed og biologisk aktivitet, hvilket beviser deres værdi i prækliniske undersøgelser.
Adeno-associeret virus (AAV) er blevet en stadig mere værdifuld vektor for in vivo genlevering og gennemgår i øjeblikket humane kliniske forsøg. Imidlertid gør de almindeligt anvendte metoder til rensning af AAV’er brug af cæsiumchlorid eller iodixanol densitetsgradient ultracentrifugering. På trods af deres fordele er disse metoder tidskrævende, har begrænset skalerbarhed og resulterer ofte i vektorer med lav renhed. For at overvinde disse begrænsninger vender forskere deres opmærksomhed mod kromatografiteknikker. Her præsenterer vi en optimeret heparinbaseret affinitetskromatografiprotokol, der fungerer som et universelt indfangningstrin til oprensning af AAV’er.
Denne metode er afhængig af den iboende affinitet af AAV serotype 2 (AAV2) for heparansulfatproteoglycaner. Specifikt indebærer protokollen co-transfektion af plasmider, der koder for de ønskede AAV-capsidproteiner med AAV2-proteiner, hvilket giver mosaik-AAV-vektorer, der kombinerer egenskaberne af begge forældreserotyper. Kort sagt, efter lysering af producentceller, renses en blanding indeholdende AAV-partikler direkte efter en optimeret enkelttrins heparinaffinitetskromatografiprotokol under anvendelse af et standard hurtigt proteinvæskekromatografisystem (FPLC). Oprensede AAV-partikler koncentreres efterfølgende og underkastes omfattende karakterisering med hensyn til renhed og biologisk aktivitet. Denne protokol tilbyder en forenklet og skalerbar tilgang, der kan udføres uden behov for ultracentrifugering og gradienter, hvilket giver rene og høje virale titere.
Adeno-associeret virus (AAV) vektor erobrer sin vej som et af de mest lovende leveringssystemer i nuværende genterapistudier. AAV blev oprindeligt identificeret i 19651 og er en lille, ikke-indhyllet virus med et ikosaedrisk proteinkapsid på ca. 25 nm i diameter, der har et enkeltstrenget DNA-genom. AAV’er tilhører Parvoviridae-familien og Dependoparvovirus-slægten på grund af deres unikke afhængighed af co-infektion med en hjælpervirus, såsom herpes simplex-virus eller hyppigere adenovirus, for at fuldføre deres lytiske cyklus 2,3.
AAV’ernes 4,7 kilobase-genom består af to åbne læserammer (ORF’er) flankeret af to inverterede terminalgentagelser (ITR’er), der danner karakteristiske T-formede hårnåleender4. ITR’er er de eneste cis-virkende elementer, der er kritiske for AAV-pakning, replikering og integration, og er derfor de eneste AAV-sekvenser, der er bevaret i rekombinante AAV (rAAV) vektorer. I dette system leveres de gener, der er nødvendige for vektorproduktion, separat i trans, hvilket gør det muligt at pakke genet af interesse inde i det virale kapsid 5,6.
Hvert viralt gen kodificerer forskellige proteiner gennem alternativ splejsning og startkodoner. Inden for Rep ORF er fire ikke-strukturelle proteiner (Rep40, Rep52, Rep68 og Rep78) kodet, hvilket spiller afgørende roller i replikation, stedspecifik integration og indkapsling af viralt DNA 7,8. Cap ORF fungerer som en skabelon for ekspressionen af tre strukturelle proteiner, der adskiller sig fra hinanden ved deres N-endestation (VP1, VP2 og VP3), der samles til dannelse af et 60-mer viralt kapsid i forholdet 1:1:10 4,9. Derudover koder en alternativ ORF indlejret i Cap-genet med et ikke-konventionelt CUG-startcodon for et samlingsaktiverende protein (AAP). Dette nukleare protein har vist sig at interagere med de nyligt syntetiserede capsidproteiner VP1-3 og fremme capsidsamling10,11.
Forskelle i kapsidets aminosyresekvens tegner sig for de 11 naturligt forekommende AAV-serotyper og over 100 varianter isoleret fra mennesker og ikke-humant primatvæv 7,12,13. Variationer i konformationen af strukturelt variable regioner styrer de forskellige antigene egenskaber og receptorbindende specificiteter af kapsider fra forskellige stammer. Dette resulterer i forskellige vævstropismer og transduktionseffektivitet på tværs af forskellige pattedyrorganer14.
Tidlige produktionsmetoder for rAAV’er var afhængige af adenovirusinfektion til hjælperformål 15,16,17,18,19. På trods af at det er effektivt og normalt let at producere i stor skala, opstår der flere problemer som følge af denne infektion. Selv efter rensning og et varmedenatureringstrin til inaktivering kan adenovirale partikler stadig være til stede i AAV-præparater, hvilket udgør et uønsket sikkerhedsproblem20. Desuden er tilstedeværelsen af denaturerede adenovirale proteiner uacceptabel til klinisk brug. Andre produktionsstrategier drager fordel af rekombinante herpes simplex-virusstammer, der er konstrueret til at bringe Rep / Cap og transgen ind i målcellerne21 eller af baculovirus-insektcellesystemet22. Selvom disse systemer tilbyder fordele med hensyn til skalerbarhed og GMP-kompatibilitet, står de stadig over for lignende problemer.
Den tredobbelte transfektionsmetode til rAAV-produktion er almindeligt vedtaget for let at overvinde disse problemer. Kort fortalt er rAAV-samlingen afhængig af forbigående transfektion af celler med tre plasmider, der koder for: 1) transgenekspressionskassetten pakket mellem ITR’erne fra vildtype AAV2-genomet (pITR); 2) de Rep/Cap-sekvenser, der er nødvendige for replikering og virionsamling (pAAV-RC); og 3) de minimale adenovirale proteiner (E1A, E1B, E4 og E2A) sammen med de adenovirusvirusassocierede RNA’er, der kræves til hjælpereffekten (pHelper) 6,20,23. Mens plasmidtransfektionsmetoder giver enkelhed og fleksibilitet til rAAV-produktion i prækliniske undersøgelser, har disse procedurer begrænsninger med hensyn til skalerbarhed og reproducerbarhed, når de anvendes til storskalaproduktion. Som en alternativ tilgang kan rAAV-produktion opnås ved anvendelse af AAV-producentcellelinjer (med både vedhængende og suspensionsvækst), der stabilt udtrykker enten AAV Rep / Cap-gener eller Rep / Cap i kombination med vektorkonstruktioner. I disse systemer introduceres de adenovirale hjælpergener gennem plasmidtransfektion. Selvom denne strategi forbedrer skalerbarheden af cellekulturprocessen, er den teknisk kompleks og tidskrævende 21,24,25.
I begge tilfælde lyseres producentcellerne derefter og underkastes et eller flere rensningstrin. I øjeblikket omfatter de vigtigste metoder til rensning af rAAV’er anvendelse af cæsiumchlorid (CsCl) eller iodixanol centrifugering med ultrahøj densitetsgradient efterfulgt eller ej af kromatografiteknikker26. Det oprindelige rensningsskema for viral udfældning anvendte ammoniumsulfat efterfulgt af to eller tre runder ultracentrifugering gennem en CsCl-gradient. De vigtigste fordele ved denne proces omfatter muligheden for at rense alle serotyper og evnen til fysisk at adskille fulde partikler fra tomme kapsider baseret på deres forskellige tætheder. Denne metode er imidlertid omfattende, tidskrævende og har begrænset skalerbarhed, hvilket ofte resulterer i dårligt udbytte og lav prøvekvalitet 27,28,29,30. Desuden er dialyse mod en fysiologisk buffer ofte nødvendig før in vivo-undersøgelser på grund af de toksiske virkninger, som CsCl kan udøve på pattedyr.
Iodixanol er også blevet brugt som et alternativt iso-osmotisk gradientmedium til at rense rAAV-vektorer, med fordele i forhold til CsCl fra både sikkerheds- og vektorstyrkesynspunkt. Ligesom CsCl præsenterer iodixanolmetoden imidlertid nogle ulemper relateret til belastningskapaciteten af cellekulturlysat (og dermed skalerbarheden af rAAV-oprensning), og det forbliver en tidskrævende og dyr metode30,31.
For at overvinde disse begrænsninger vendte forskerne deres opmærksomhed mod kromatografiteknikker. I denne henseende blev der udviklet flere oprensningsmetoder, der enten inkorporerer affinitets-, hydrofobe eller ionbytterkromatografimetoder. Disse metoder er afhængige af de biokemiske egenskaber af en bestemt serotype, herunder deres naturlige receptorer, eller ladningsegenskaberne for den virale partikel32. For eksempel åbnede opdagelsen af, at AAV2, AAV3, AAV6 og AAV13 fortrinsvis binder til heparansulfatproteoglycaner (HSPG), muligheden for at anvende det nært beslægtede heparin i affinitetskromatografirensning. Imidlertid kan bindingsstederne til HSPG variere mellem serotyper, mediere AAV-binding og infektion af målceller på forskellige måder 2,33,34,35,36. På den anden side binder AAV1, AAV5 og AAV6 til N-bundet sialinsyre (SA), mens AAV4 bruger O-bundet SA 2,14,34. Efter samme rationale er der også udviklet en enkelttrins affinitetskromatografiprotokol til oprensning af rAAV5 baseret på brugen af mucin, et pattedyrprotein, der er højt beriget i SA37. Ligesom heparinbaserede teknikker er denne oprensning også afhængig af den specifikke serotype, der genereres. Bortset fra heparin og mucin er andre ligander blevet undersøgt for affinitetskromatografi, såsom A20 monoklonalt antistof og kamelid enkeltdomæneantistoffer (AVB Sepharose og POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41. Andre innovative strategier til forbedring af de tidligere eksisterende rensningsmetoder involverer indførelse af små modifikationer i rAAV-kapsidet for at præsentere specifikke bindende epitoper. For eksempel kan hexa-histidin-mærkede eller biotinylerede rAAV’er renses ved hjælp af ligander, der er målrettet mod disse epitoper (henholdsvis nikkelnitrilotrieddikesyre og avidinharpikser)42,43,44.
I et forsøg på at udvide de ønskede egenskaber ved rAAV’er har efterforskere krydsklædt virionerne ved at blande deres kapsider. Dette opnås ved at tilføre capsidgenet fra to forskellige AAV-serotyper i ækvimolære eller forskellige forhold under produktionen, hvilket giver anledning til en capsidstruktur sammensat af en blanding af capsidunderenheder fra forskellige serotyper 34,45,46,47,48,49,50. Tidligere undersøgelser giver fysisk bevis for, at co-ekspression af capsidproteiner fra AAV2 med AAV1 (1: 1-forhold) og AAV2 med AAV9 (1: 1-forhold) resulterer i generering af mosaik rAAV1/2 og rAAV2/9-vektorer, henholdsvis 45,46,48. En stor fordel ved genereringen af mosaik rAAV’er er evnen til at integrere fordelagtige træk fra forskellige AAV-serotyper, hvilket resulterer i synergistiske forbedringer i transgenekspression og tropisme, samtidig med at andre egenskaber, der er nyttige under rAAV-produktion, opretholdes. Interessant nok udviser visse mosaikvarianter endda nye egenskaber, der adskiller sig fra begge forældrevirus 46,47,49. Ved at udnytte AAV2’s heparinbindende evne kan mosaik rAAV-vektorer potentielt genereres og renses ved at blande AAV2 med andre naturlige eller nye AAV-kapsider genereret af rettet evolution og / eller rationelt design. Ikke desto mindre har tidligere undersøgelser fremhævet vigtigheden af capsid-underenhedskompatibilitet, når man forsøger at samle mosaikvektorer. For eksempel viste Rabinowitz og kolleger, at selvom transkapsidationen af AAV1, AAV2 og AAV3 førte til en effektiv samling af mosaikkapsider, forhindrede krydsdressing af disse serotyper med AAV4 dannelsen af stabile virioner 34,45,47. Derudover viste AAV1, AAV2 og AAV3 lav kompatibilitet med AAV5 i betragtning af de reducerede virale titere opnået ved blanding af disse kapsider i forskellige forhold. Interessant nok viste mosaik rAAV2/5 nedsatte heparinbindende egenskaber, samtidig med at mucinbindingsevnen blev opretholdt som forældrenes AAV5. Imidlertid bevarede rAAV3/5 i forholdet 3: 1 den dobbelte binding til heparin og mucin. Samlet set kan genereringen af nye mosaik-rAAV’er med forbedret transduktion, specifik tropisme eller lav immunogenicitet i høj grad drage fordel af vores forståelse af capsidsamling og receptorinteraktioner, hvor specifikke kombinationer stadig kræver grundig undersøgelse og optimering.
I dette arbejde beskriver vi en trin-for-trin protokol til produktion og oprensning af rAAV’er ved hjælp af en optimeret heparinaffinitetskromatografimetode. rAAV’er fremstilles ved forbigående transfektion og renses ved hjælp af et hurtigt proteinvæskekromatografisystem (FPLC). Efter koncentrationen af udvalgte oprensede fraktioner karakteriseres de resulterende virale bestande med hensyn til titer, renhed, iboende fysiske egenskaber og biologisk aktivitet in vitro og in vivo. Som et bevis på konceptet demonstrerer vi forbedringerne og anvendeligheden af denne protokol til generering af mosaik rAAV1/2 og rAAV2/9 vektorer. Valget af hver serotype var baseret på deres slående forskellige tropismer, hvilket potentielt også gav deres unikke egenskaber til mosaikversionerne. AAV serotype 1, med en generel moderat tropisme for centralnervesystemet (CNS), har evnen til at transducere neuroner og glia (i mindre grad) og gennemgår aksonal transport i anterograd og retrograd retninger in vivo 2,7,8. Derudover blev AAV serotype 9 valgt for sin naturlige evne til at krydse blod-hjerne-barrieren og målrette CNS i både nyfødte og voksne mus51,52. Endelig blev AAV serotype 2 valgt på grund af dets evne til at binde til heparin, hvilket tillader affinitetskromatografi33. De oprensede rAAV1/2- og rAAV2/9-partikler kombinerer egenskaberne af begge forældre-AAV-serotyper og udgør derfor egnede vektorer til transduktion af CNS 45,46,48,49.
Det hurtigt voksende AAV-vektorværktøjssæt er blevet et af de mest lovende genleveringssystemer til en lang række celletyper gennem forskellige administrationsveje. I dette arbejde havde vi til formål at udvikle en forbedret protokol til produktion, oprensning og karakterisering af mosaik rAAV-vektorer, der kunne bevise deres værd i prækliniske undersøgelser. Til dette formål beskrives genereringen af rAAV1/2 og rAAV2/9 mosaikvektorer her, men proceduren kan også anvendes til at rense standard rAAV2-vektorer (data ikke vist).
Mosaic rAAV’er blev produceret efter en optimeret transfektionsmetode ved anvendelse af PEI som transfektionsreagens. En forbigående transfektionsmetode blev valgt på grund af dens større fleksibilitet og hastighed, betydelige fordele i tidlige prækliniske undersøgelser. Når et bestemt transgen og en bestemt serotype er blevet valideret, kan produktionssystemet finjusteres for at opnå bedre skalerbarhed og omkostningseffektivitet ved at etablere en stabil transfekteret cellelinje, der udtrykker en delmængde af de specifikke Rep/Cap-gener , med yderligere gener tilvejebragt af en infektionsproces24. Sammenlignet med calciumphosphattransfektion giver PEI flere fordele. Det er et stabilt og omkostningseffektivt transfektionsreagens, der fungerer effektivt inden for et bredere pH-område. Derudover eliminerer det kravet om at ændre cellemediet efter transfektion, hvilket resulterer i en betydelig reduktion i både omkostninger og arbejdsbyrde69.
I et forsøg på at omgå nogle af de begrænsninger, der blev pålagt af CsCl- eller iodixanolgradienter, blev de producerede rAAV’er høstet og renset ved affinitetskromatografi. Denne strategi tilbyder en forenklet og skalerbar tilgang, der kan udføres uden behov for ultracentrifugering og gradienter, hvilket giver rene og høje virale titere. Faktisk kan kromatografiteknikker ved hjælp af et FPLC-system automatiseres og skaleres op ved at pakke mere harpiksvolumen i en søjle med en højere sengehøjde. Protokollen beskrevet heri kan let tilpasses til at inkorporere 5 ml HiTrap Heparin HP-søjler (data ikke vist). Derudover kan heparinkolonner genbruges flere gange, hvilket bidrager til omkostningseffektiviteten af denne metode.
De oprensede rAAV’er blev derefter karakteriseret med hensyn til titer, renhed, morfologiske træk og biologisk aktivitet. Interessant nok blev der i Coomassie-blå farvning påvist et bånd med ca. 17 kDa i fraktioner F8-F16 ud over de tre typiske virale capsidproteiner. Dette bånd er imidlertid ikke længere til stede efter koncentrationstrinnet af rAAV’er. Desuden kan nogle svage bånd med molekylvægte lavere end VP3 (<62 kDa) også detekteres ved B1- og A69-mærkning, hvilket tyder på, at disse kan være fragmenter af VP1-, VP2- og VP3-capsidproteinerne70. En anden mulighed er, at disse faktisk er andre co-rensende proteiner såsom ferritin eller andre cellulære proteiner med polypeptider, der deler lignende proteinfingeraftryk med AAV-capsidproteinerne og kunne være involveret i AAV-biologien, som tidligere foreslået 26,71,72.
TEM og bedøvelsesanalyse afslørede også tilstedeværelsen af tomme partikler på variable niveauer på tværs af forskellige produktioner. Tilsvarende rapporterede andre undersøgelser tidligere generering af variable og høje niveauer (>65%) af tomme kapsider til rAAV’er fremstillet ved transfektions- eller infektionsmetoder24,73. Mekanismen bag rAAV-generering starter med den hurtige dannelse af tomme kapsider fra nyligt syntetiserede VP-proteiner efterfulgt af et langsomt hastighedsbegrænsende trin af genompakning i de præformerede kapsider medieret af Rep-proteiner74,75. Derfor genereres tomme kapsider i rAAV-produktioner, selvom andelen af tomme og fulde kapsider kan variere afhængigt af størrelsen og sekvensen af transgenet af interesse og cellekulturbetingelser58,73. Tomme kapsider giver anledning til nogle bekymringer, da de ved at mangle genomet af interesse ikke er i stand til at give en terapeutisk effekt og også potentielt kan øge et medfødt eller adaptivt immunrespons. Nogle rapporter har imidlertid også vist, at tomme AAV-kapsider ved at justere deres forhold kan tjene som yderst effektive lokkefugle til AAV-specifikke neutraliserende antistoffer og derfor øge transduktionseffektiviteten 60,76,77. Hvis tilstedeværelsen af tomme kapsider er kritisk skadelig og i betragtning af den lidt mindre anioniske karakter af tomme partikler sammenlignet med fulde vektorer, kan en potentiel løsning omfatte udførelse af et andet poleringsrensningstrin ved hjælp af anionudvekslingskromatografiteknikker64.
Denne undersøgelse giver også overbevisende bevis for, at de genererede mosaik rAAV’er er i stand til effektivt at transducere ikke kun in vitro neuronale kulturer, men også CNS ved intrakraniel injektion af rAAV1/2. Samlet set tyder disse resultater på, at den beskrevne produktions- og oprensningsprotokol gør meget rene og biologisk aktive rAAV’er klar til brug på 6 dage og præsenterer sig selv som en alsidig og omkostningseffektiv metode til generering af rAAV’er i prækliniske studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for samarbejdet, indsigten og den tekniske assistance fra Dr. Mónica Zuzarte ved Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) og Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB) vedrørende TEM-analysen af rAAV’er. Vi udvider vores påskønnelse til Dr. Dominique Fernandes ved Center for Neurovidenskab og Cellebiologi ved University of Coimbra (CNC-UC) og Institut for tværfaglig forskning ved University of Coimbra (IIIUC) for hendes uvurderlige tekniske assistance og indsigt i de primære neuronale kultureksperimenter. PRV1-, pH21- og pFdelta6-plasmider, der er afgørende for denne undersøgelse, blev generøst leveret af Dr. Christina McClure ved School of Medical Sciences, College of Life Sciences and Medicine, University of Aberdeen, som vi er taknemmelige for. Dette arbejde blev finansieret af Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU) gennem det regionale operationelle program Centro 2020. gennem det operationelle program for konkurrenceevne og internationalisering COMPETE 2020 og portugisiske nationale midler via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia under projekterne: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), ReSet – IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), Bekæmpelse af Sars-CoV-2 (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); af American Portuguese Biomedical Research Fund (APBRF) og Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph Disease Research Fund, ARDAT under IMI2 JU-tilskudsaftale nr. 945473 støttet af EU og EFPIA GeneT-Teaming Project 101059981 støttet af EU’s Horizon Europe-program. M.M.L. blev støttet af 2021.05776.BD; C.H. blev støttet af 2021.06939.BD; A.C.S. blev støttet af 2020.07721.BD; og D.D.L. blev støttet af 2020.09668.BD. Figur 1 blev oprettet ved hjælp af BioRender.com.
10% povidone-iodine | Medline | MDS093943 | |
12-well plates | Thermo Scientific | 11889684 | |
24-well plates | VWR | 734-2325 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
96-well Stunner plate | Unchained Labs | 701-2025 | 96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2 | Takara | 6233 | For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water |
Acetic acid glacial | Fisher Chemical | A/0360/PB17 | |
ÄKTA pure 25 | Cytiva | 29018224 | FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3 |
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse | Invitrogen | 31328 | |
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit | Merck Millipore | UFC5100 | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Merck Millipore | UFC9100 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | E1014 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | 184-5096 | |
ChemiDoc Touch Imaging System | Bio-Rad Laboratories | 1708370 | |
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody | Abcam | ab13970 | |
Coomassie Blue G250 | Fisher Chemical | C/P541/46 | |
Dithiothreitol (DTT) | Fisher Bioreagents | BP17225 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
ECF Substrate for Western Blotting | Cytiva | RPN5785 | |
FastDigest SmaI | Thermo Scientific | FD0663 | |
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin | FEI | Biotwin | Transmission electron microscope |
Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
Fluorescence mounting medium | Dako | S3023 | |
Formvar-carbon coated 200 mesh grid | TAAB Laboratories Equipment | F077/025 | |
Gas evacuation apparatus | RWD | R546W | |
Glycerol | Fisher BioReagents | 10021083 | |
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | |
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3 | Hamilton | 7803-07 | |
Hamilton syringe (10 µL) | Hamilton | 7653-01 | |
HEK293T | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL | Cytiva | 17040701 | Pre-packed heparin column |
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva | 17040601 | Pre-packed heparin column |
Immobilon-P PVDF Membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | |
Isoflurane | Braun | 469860 | |
Ketamine | Dechra Pharmaceuticals | N/A | Nimatek |
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 11906965 | |
Lunatic & Stunner Client software | Unchained Labs | N/A | Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
Methanol | Fisher Chemical | M/4000/FP21 | |
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69) | American Research Products | 03-61057 | |
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1) | American Research Products | 03-61058 | |
Neuro2a | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | 12738422 | |
NZYColour Protein Marker II | NZYtech | MB09002 | |
pAAV-CMV-scGFP | Addgene | 32396 | Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396 |
pAAV-CMV-ssGFP | Addgene | 105530 | Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530 |
pAAV2/9n | Addgene | 112865 | Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865 |
Paraformaldehyde | Acros Organics | 10342243 | |
PBS | Fisher BioReagents | BP2438 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x) | Gibco | 24040032 | |
Polyethylenimine MAX, MW 40,000 | Polysciences Europe | 24765 | |
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine – Isoflurane | RWD | N/A | |
Sample Inlet Valve V9-IS | Cytiva | 29027746 | |
Sample pump P9-S | Cytiva | 29027745 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 10428420 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Bioreagents | BP166 | |
Sterile PVDF syringe filter | Fisher Scientific | 15191499 | |
Stunner Platform | Unchained Labs | 700-2002 | Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
Superloop 150 mL | Cytiva | 18-1023-85 | |
Superloop 50 mL | Cytiva | 18-1113-82 | |
SURE 2 supercompetent cells | Stratagene, Agilent Technologies | HPA200152 | |
Treated culture dishes | Corning | 734-1711 | |
Tris base | Fisher BioReagents | BP152 | |
Tris hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633 | Invitrogen | W21404 | |
Xylazine | Dechra Pharmaceuticals | N/A | Sedaxylan |
Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective |
Zeiss Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective |
Zeiss LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective |
µ-Slide 8 well Ibidi | Ibidi | 80826 | 8-well chamber slide |