액체 크로마토그래피 고분해능 질량 분석법과 결합된 13C 6-Glucose 라벨링의 개발된 방법은 다재다능하며 약용 식물에서 2차 대사 산물의 합성에 관여하는 1차 장기 및 경로에 대한 향후 연구와 이러한 2차 대사 산물의 포괄적인 활용을 위한 토대를 마련합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
이 논문은 2차 대사산물 합성에 관여하는 1차 장기를 인증하기 위한 새롭고 효율적인 방법을 제시합니다. Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.)에서 가장 중요한 2 차 대사 산물로 손. -Mzt. (PPY), 파리 사포닌 (PS)은 다양한 약리 활성을 가지고 있으며 PPY에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 이 연구는 파리 사포닌 VII(PS VII) 합성에 관여하는 주요 장기를 정확하게 인증하기 위해 잎, 뿌리줄기 및 줄기-혈관-번들 13C6-포도당 공급 및 비공급 4가지 처리를 확립했습니다. 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)을 결합하여 서로 다른 처리에서 잎, 뿌리줄기, 줄기 및 뿌리의 13C/12C비율을 빠르고 정확하게 계산하고 (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− 및 (M+4) −/M−의 4가지 유형의 PS 동위원소 이온 피크(M−) 비율을 찾았습니다. 그 결과, 줄기-혈관-다발 및 뿌리줄기 섭식 처리의 뿌리줄기에서 13C/12C의 비율이 비수유 처리에서보다 유의하게 높았다. 비수유 처리와 비교했을 때, 잎 및 줄기-혈관-다발 수유 처리에서 잎의 PS VII 분자(M+2) -/M−의 비율이 크게 증가했습니다. 동시에, 비수유 처리와 비교하여, 뿌리줄기 처리 하의 잎에서 PS VII 분자(M+2) -/M−의 비율은 유의한 차이를 보이지 않았습니다. 또한, 줄기, 뿌리 및 뿌리 줄기에서 PS VII 분자 (M + 2) − / M −의 비율은 4 가지 처리간에 차이를 보이지 않았습니다. 비수유 처리와 비교했을 때, 잎 수유 처리 하의 잎에서 파리 사포닌 II(PS II) 분자 (M+2) −/M−의 비율은 유의한 차이를 보이지 않았으며, 잎 수유 처리 하의 잎에서 PS II 분자의 (M+3) −/M− 비율은 더 낮았다. 이 데이터는 PS VII의 합성을 위한 주요 기관이 잎이라는 것을 확인했다. 이는 약용 식물에서 2차 대사 산물의 합성에 관여하는 1차 기관 및 경로를 향후 식별하기 위한 토대를 마련합니다.
서론
식물에서 2차 대사 산물의 생합성 경로는 매우 특이적이고 다양한 축적 기관을 포함하여 복잡하고 다양합니다1. 현재 많은 약용 식물에서 2차 대사 산물에 대한 특정 합성 부위와 책임 기관은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이러한 모호성은 의약 재료의 수확량과 품질을 모두 최적화하도록 설계된 재배 방법의 전략적 발전과 구현에 심각한 장애물이 됩니다.
분자 생물학, 생화학 및 동위원소 표지 기술은 약용 식물 2,3,4,5에서 2 차 대사 산물의 합성 경로 및 위치를 밝히기 위해 광범위하게 사용되며, 이러한 각 방법론은 효율성 및 정확성의 차이와 같은 고유 한 강점과 한계를 나타냅니다. 예를 들어, 분자 생물학 접근법은 생합성 경로 내의 위치를 정확히 찾아내는 데 높은 정밀도를 제공하지만 특히 시간이 많이 걸립니다. 이들의 유용성은 공개적으로 이용 가능한 게놈 염기서열이 없는 종에 대해 더욱 제한되며, 이러한 경우에는 이러한 기술의 실행 가능성을 떨어뜨린다
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 실험 준비
- 식물이 자라는 동안 온실의 상대 습도는 75%, 낮/밤 온도는 20°C/10°C, 광주는 낮 12시간, 밤 12시간으로 구성되며 광도는 100μmol·m-2·s-1인지 확인하십시오. 발광 다이오드(LED) 램프를 통해 조도를 제공하고 LED 램프와 식물 캐노피 사이에 30cm의 거리를 유지합니다.
참고: 광주기와 광도는 윈난성의 성장 기간 동안 일조 시간의 수에 따라 다릅니다. 방사 조도는 일반적으로 양자 센서에 의해 측정됩니다( 재료 표 참조). 약용 식물의 특성에 따라 환경 매개 변수를 필요한 변경하십시오. 이러한 환경 조건이 식물의 특성과 지역별 햇빛 프로파일에 따라 신중하게 조정된 후에는 실험 기간 동안 이러한 환경에서 일관성을 유지하는 것이 중요합니다. 초기 설정 후 환경 매개변수를 임의로 변경하면 실험의 무결성과 결과의 신뢰성이 손상될 수 있습니다. - 실험의 정확성과 특이성을 보장하기 위해 수경재배 접근법18 을 사용하십시오. 세척한 2년 된 PPY 묘목(윈난성 원산(104°11′E, 23°04′N)에서 수확)을 Hoagland의 영양 용액의 1/4
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
뿌리줄기에서 13C 6-Glucose 공급이 성공적이었는지 확인하기 위해 뿌리줄기에서 13C/12C 동위원소 비율을 추가로 분석했습니다. 처리 3과 4의 13°C/12C동위원소 비율은 처리 2의 동위원소 비율보다 훨씬 높았습니다(그림 1A). 그 결과, 처리 3 및 4의 13C 6-Glucose가 섭취를 통해 뿌리 줄기에 들어간 것으로 나타났습니다.
(M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− 및 (M+4) −/M−와 같은 13개의 C 동위원소 피크의 비율은 일반적으로 일정하게 유.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜의 성공적인 구현은 식물의 생리학적 특성, 조직, 장기 및 2차 대사 산물에 대한 포괄적인 연구에 달려 있습니다. 프로토콜에 요약된 실험 설계 접근법은 식물 2차 대사 산물의 생합성 경로를 조사하기 위한 강력한 토대를 마련합니다. 이 실험에서 중요한 요소는 (1) 다년생 묘목의 나이를 결정하고 (2) 올바른 동위원소 라벨링 검출 타이밍을 선택하는 것입니다. 약용 식물은 다년생 식물과 일년생 식물로 분류되며, 각각 2 차 대사 산물 합성 및 축적 패턴이 다릅니다. 이 실험은 약용 식물에서 2차 대사 산물의 1차 합성 기관을 이러한 대사 산물의 합성 속도를 분석하여 명확히 하는 것을 목표로 합니다. 따라서 이러한 합성 패턴과 속도에 해당하는 성장 연도와 단계를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다.
PPY는 다년생 약용 식물이며 PS의 함량은 해마다 축적됩니다. 그러나, PS 종합의 비율은 다년생 식물의 PPY22의 그것과 다르지 않.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단의 청소년 프로그램 (No. 82304670)의 자금 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.1% 포름산수 | Chengdu Kelong 화학 시약 공장 | 44890 | |
| 13C6-Glucose powder | MERCK | 110187-42-3 | |
| Acetonitrile | Chengdu Kelong 화학 시약 공장 | 44890 | |
| AUTOSAMPLER 바이알스 | Biosharp 생명공학 회사 | 44866 | |
| BEH C18 열 | Waters, Milfor, MA | 1.7μ m,2.1*100 mm | |
| CNC 초음파 세척기 | Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd | KQ-600DE | |
| Compound DiscovererTM 소프트웨어 | Thermo Scientific, Fremont,CA | 3 | |
| Compound DiscovererTM 소프트웨어 | Thermo Scientific, Fremont, CA | 3 | |
| 전기 항온 폭발 건조 오븐 | DHG-9146A | ||
| 전자 분석 저울 | Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd | SOP | |
| 에탄올 | Chengdu Kelong 화학 시약 공장 | 44955 | |
| 완전 자동 샘플 급속 분쇄기 | Shanghai Jingxin Technology | Tissuelyser-48 | |
| 가스 크로마토그래피 - 안정 동위원소 비율 질량 분석기 | Thermo Fisher | Delta V Advantage | |
| Hoagland 솔루션 | Sigma-Aldrich | H2295-1L | |
| 수경 탱크 | JRD | 1020421 | |
| Isodat 소프트웨어 | Thermo Fisher Scientific | 3 | |
| 액체 크로마토그래피 고분해능 질량 분석기 | Agilent Technology | 애질런트 1260 -6120 | |
| 질소 제조 기기 | PEAK SCIENTIFIC | Genius SQ 24 | |
| 유기상 필터 | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | 44890 | |
| 산소 펌프 | Magic Dragon | MFL | |
| 양자 센서 | Highpoint | UPRtek | |
| 메스 | Handskit | 11-23 | |
| 뿌리기 CHUSHI | WJ-001 | ||
| Xcalibur 소프트웨어 | Thermo Fisher Scientific | 4.2 |
참고문헌
- Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
- Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
