트로판 알칼로이드의 고속 질량 분석법(MS)/질량 분석법(MS) 기반 주석 및 분류를 위한 방법을 제시하며, 이는 트로판 함유 샘플의 예비 복제 및 분리를 위한 새로운 알칼로이드의 발견 모두에 유용합니다.
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방법 논문
천연 제품 연구에서 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법의 응용 분야: 사례 연구로서의 트로판 알칼로이드
이 논문에서
요약
초록
오늘날 사용되는 많은 약물이 합성 원료이지만, 천연 제품은 여전히 새로운 화학적 다양성과 생체 활성의 풍부한 원천을 제공하며 내성 또는 신종 질병에 대한 유망한 단서를 제공할 수 있습니다. 그러나 도전 과제는 두 가지입니다: 연구자들은 천연 제품을 찾고 그 구조를 밝혀야 할 뿐만 아니라 분리하고 분석할 가치가 있는 것(그리고 이미 알려진 것 - 역복제라고 알려진 프로세스)을 식별해야 합니다. 최신 분석 기기의 출현으로 천연물 발견 및 복제 해제의 속도가 가속화되었습니다. 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)은 화학 구조를 식별하고 분류하는 데 특히 유용한 기술이 되었습니다. 트로판 알칼로이드(TA)는 의학 및 독성학적으로 중요한 식물 유래 화합물입니다. 이 연구에서는 QQQ(Triple-Quadrupole) 질량분석기에서 사용할 수 있는 여러 MS/MS 구성을 활용하여 고유한 단편화 패턴을 기반으로 TA 구조에 주석을 달고 분류하는 LC-MS/MS 기반 스크리닝 워크플로우를 개발했습니다. 데이터 의존형(DD) 제품 이온 스캔, 전구체 이온 스캔(PrIS) 및 중성 손실 스캔(NLS)의 조합을 사용하여 이 방법을 밤나무 Datura stramonium 및 Datura metel 의 TA가 풍부한 추출물에 적용했습니다.이 방법은 빠르고 민감하며, 복잡한 TA 함유 샘플의 예비 복제 제거와 분리, 정제(및 최종 생물학적 분석)를 위한 새로운 후보 물질의 발견에 성공적으로 사용되었습니다.
서론
최근 수십 년 동안 완전 합성 분자가 신약 개발에서 더욱 두드러지게 되었지만, 지난 39년 동안 승인된 모든 약물의 거의 3분의 2가 천연 제품 또는 천연 제품에서 영감을 받은 약물입니다.1,2 이는 천연 제품 연구의 지속적인 중요성을 강조합니다. 특정 질소 함유 천연 제품인 알칼로이드는 특히 의약 특성으로 인해 높이 평가됩니다. [3.2.1.]을 포함하는 트로판 알칼로이드(TA)-이환 질소 함유 시스템은 주로 Solanaceae (nightshade), Erythroxylaceae 및 Convolvulaceae 계통의 식물에 의해 생산됩니다. 예로는 아트로핀, 스코폴라민 및 코카인이 있습니다. 여러 반합성 또는 합성 트로판도 임상적으로 사용됩니다3. TA와 그 유도체는많은 질환을 치료하는 데 사용되며3,4 이러한 약물 중 일부는 WHO의 2023년 필수 의약품 목록(List of Essential Medicines)에 등재되어 있습니다
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프로토콜
주의: 나열된 화학 물질을 사용하기 전에 모든 관련 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오.
1. 시료 전처리
주의: 액체 질소는 극저온 화상을 유발할 수 있습니다. 환기가 잘 되는 곳에서 극저온 장갑과 보안경을 사용하십시오. 알칼로이드 함유 식물 샘플은 피부에 자극을 줄 수 있습니다. 항상 장갑으로 다루십시오. 메탄올은 독성이 있고 가연성이므로 잠재적인 발화원에서 멀리 떨어진 흄 후드에서 취급해야 합니다.
참고: 이론적으로 재배 또는 야생 식물 조직을 사용할 수 있습니다(건조 또는 신선하게 분쇄). 아래 절차는 분석법 개발 중에 사용되는 절차입니다.
- 관심 있는 식물 조직이 신선하면 폴리프로필렌 원추형 튜브에 넣고 액체 질소에 2-3분 동안 담가 얼립니다.
- 얼어 붙은 식물 조직을 미리 냉각 된 모르타르 (액체 질소가 들어간 폴리스티렌 쿨러에)에 넣고 미리 냉각 된 유봉을 사용하여 조직을 균일 한 분말로 갈아줍니다.
- 미리 냉각된 주걱을 사용하여 원하는 양의 조직을 중량이 측정된 폴리프로필렌 미세 원심분....
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결과
이 방법의 효과를 입증하기 위해 TA의 표준 혼합물(아세틸트로핀/아세틸슈도트로핀 혼합물[단일치환] 각각 10μg/mL, 히오시아민[단일치환], 리토린[단일치환] 및 스코폴라민[삼치환]과 함께 2개의 아니소다민 이성질체[이치환]의 혼합물 각각 10μg/mL)을 양성 대조군으로 분석했습니다(그림 2). 전체 Q1 스캔 크로마토그램(기본 피크 크로마토그램 보기에 표시)은 그림 2A에 나와 있으며, TA 표준 구조는 해당 피크로 표시됩니다. m/z 124에 대한 PrIS(그림 2B)는 단일치환 TA에 대한 크로마토그램의 피크를 표시합니다. Ergo, 아세틸트로핀/슈도트로핀 혼합물, 히오시아민 및 리토린이 표시됩니다. m/z 124 크로마토그램에서 아세틸트로핀 및 슈도트로핀에 해당하는 피크는 작습니다(다른 표준물질보다 농도가 낮고 다른 단일치환 T.......
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토론
프로토콜에 제공된 계측기 매개변수는 만족스러운 성능을 허용하지만 이 방법을 성공적으로 사용하려면 몇 가지 중요한 단계에 세심한 주의를 기울이거나 최적화해야 할 수 있습니다. 2.2단계에서 제공된 HPLC 용매 그래디언트는 일반적으로 트로판 알칼로이드에 적합하지만, 시료 또는 검사 중인 식물 종의 트로판 알칼로이드 프로파일에 따라 수정해야 할 수도 있습니다. 시료 주입량은 기기의 감도와 분석법 사용 방법에 따라 변경될 수도 있습니다. "심층" 대사 프로파일링 또는 역복제는 더 큰 주입 부피(이 연구에서는 15-20 μL가 사용됨)를 사용해야 하는 반면, 알칼로이드의 간단한 검출은 더 작은 부피를 사용할 수 있습니다. (a) 이온 소스를 정기적으로 세척하고, (b) HPLC 컬럼의 압력 변화 또는 막힘을 모니터링하고(항상 적절한 가드 컬럼을 사용해야 함), (c) 시료 간 캐리오버를 방지하고, (d) 위에서 설명한 대로 크로마토그램에서 잠재적인 "동위원소 누출"을 검사하기.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 교수 연구 보조금(Northern Michigan University, M.A.C.에 수여), 학부 연구 펠로우십(Northern Michigan University, J.C.에 수여) 및 화학과에서 자금을 지원받았습니다. 저자들은 식물 조직 준비를 도와준 John Berger(NMU), LC-MS 유지 관리 및 문제 해결 지원을 제공한 Hannah Hawkins(NMU), 아세틸트로핀 혼합물을 준비해 준 Ryan Fornwald 박사와 그의 CH 495(Natural Products Synthesis) 학생들에게 감사를 표하고자 합니다. 저자들은 또한 고분해능 MS/MS 스펙트럼을 획득한 Daniel Jones 박사(Michigan State University)에게 감사의 뜻을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세토니트릴, UHPLC용, 질량 분석에 적합 | 시그마-알드리치 | 900667 | HPLC 용매 |
| 아르곤 가스 | AirGas | AR UHP300 | CID 가스 |
| 포름산, 분석용 99% | Thermo Scientific | AC270480010 | HPLC 첨가제 |
| 가드 컬럼 홀더 | Restek | 25812 | |
| HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus | Shimadzu | 228-65802-58 | HPLC 컬럼 |
| LCMS, Shimdazu LCMS-8045 | Shimadzu | 225-31800-44 | 질량 분석기; 우리는 LabSolutions 소프트웨어를 실행했습니다. 이는 Shimadzu 기기의 표준입니다 |
| 액체 질소 | AirGas | NI 180LT22 | |
| 메탄올, HPLC/UHPLC/LCMS | VWR | BDH 85800.400 | 추출 용매 |
| Microcentrifuge를 만들기 위해 | VWR | 2400-37 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 모르타르 | Fisher Scientific | FB961C | 식물 조직 분쇄용 |
| Pestle | Fisher Scientific | FB961M | 식물 조직 분쇄용 |
| 피펫 1000 mL | Gilson | ||
| 피펫 팁 1000 mL | Fisher scientific | 02-707-404 | |
| 식물 조직 | 다양한 출처 | N/A | 야생이나 재배 무엇이든 될 수 있음 |
| 폴리프로필렌 원뿔형 튜브, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-4 | |
| 폴리스티렌 냉각기 | ULINE | S-18312 | 분자 생물학용 시약이 배송되는 냉각기의 유형은 다음과 같습니다. 적절한 |
| Roc C18 3 &마이크로; m, 100 mm x 4.6 mm | Restek | 9534315 | HPLC 컬럼 |
| Roc C18, 10 mm x 4 mm | Restek | 953450210 | Guard 컬럼 |
| Rocking shaker | Themo Scientific | 11-676-680 | |
| 나사산 바이알 편의 키트(9 mm) | Fisher Scientific | 13-622-190 | LCMS 자동시료주입기 바이알 |
| 주사기, 3 mL | Fisher Scientific | 03-377-27 | |
| 주사기 필터 0.45 µ 엠 | Avantor/VWR | 76479-008 | |
| 물, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석에 사용 | JT Baker | 9831-03 | 추출 용매 제조용 |
| 수용액, 0.1% v/v 포름산 포함, UHPLC의 경우 질량 분석 | Sigma-Aldrich | 900687-1L | HPLC 용매 |
참고문헌
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981....
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