خميرة الانشطار كمنصة لشاشات الأدوية المضادة للبكتيريا التي تستهدف بروتينات الهيكل الخلوي البكتيرية
Summary
تستخدم خميرة الانشطار هنا كمضيف غير متجانس للتعبير عن البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية مثل FtsZ و MreB كبروتينات اندماج متعدية مع GFP لتصور بلمرتها. أيضا ، يتم تحديد المركبات التي تؤثر على البلمرة عن طريق التصوير باستخدام المجهر الفلوري.
Abstract
تؤدي البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية مثل FtsZ و MreB وظائف أساسية مثل انقسام الخلايا والحفاظ على شكل الخلية. علاوة على ذلك ، برزت FtsZ و MreB كأهداف مهمة لاكتشاف مضادات الميكروبات الجديدة. تم تطوير العديد من المقايسات لتحديد المركبات التي تستهدف ربط النوكليوتيدات وبلمرة هذه البروتينات الهيكلية الخلوية ، والتي تركز بشكل أساسي على FtsZ. علاوة على ذلك ، فإن العديد من الفحوصات إما شاقة أو كثيفة التكلفة ، والتأكد مما إذا كانت هذه البروتينات هي الهدف الخلوي للدواء غالبا ما يتطلب طرقا متعددة. أخيرا ، تشكل سمية الأدوية للخلايا حقيقية النواة مشكلة أيضا. هنا ، نصف مقايسة قائمة على الخلية من خطوة واحدة لاكتشاف جزيئات جديدة تستهدف الهيكل الخلوي البكتيري وتقليل الضربات التي قد تكون سامة للخلايا حقيقية النواة. خميرة الانشطار قابلة للشاشات عالية الإنتاجية القائمة على الفحص المجهري ، ويمكن للشاشة المرئية التعرف بسهولة على أي جزيء يغير بلمرة FtsZ أو MreB. يستخدم الفحص الخاص بنا الصفيحة القياسية المكونة من 96 بئرا ويعتمد على قدرة البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية على البلمرة في خلية حقيقية النواة مثل خميرة الانشطار. في حين أن البروتوكولات الموصوفة هنا مخصصة لخميرة الانشطار وتستخدم FtsZ من المكورات العنقودية الذهبية و MreB من الإشريكية القولونية ، إلا أنها قابلة للتكيف بسهولة مع البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية الأخرى التي تتجمع بسهولة في البوليمرات في أي مضيفات تعبير حقيقية النواة. يجب أن تساعد الطريقة الموصوفة هنا في تسهيل اكتشاف المزيد من مضادات الميكروبات الجديدة التي تستهدف البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية.
Introduction
خلقت المقاومة الواسعة النطاق لجميع المضادات الحيوية المستخدمة حاليا لمكافحة الالتهابات البكتيرية ضرورة فورية لفئات جديدة من المضادات الحيوية. أشار تقرير صدر عام 2019 إلى أن العدوى المقاومة للمضادات الحيوية أدت إلى فقدان 1.27 مليون شخص ، مما ساهم في حصيلة إجمالية بلغت 4.95 مليون حالة وفاة عند النظر في مضاعفات العدوى البكتيرية المقاومة1. في حين أن الترسانة الحالية من المضادات الحيوية لا تزال فعالة في الممارسة السريرية ، إلا أنها تستهدف في الغالب طيفا ضيقا من العمليات الخلوية ، مع التركيز بشكل أساسي على جدار الخلية والحمض النووي وتخليق البروتين. على مدى نصف القرن الماضي ، تم استغلال أقل من 30 بروتينا تجاريا كأهداف لتطوير مضادات جديدة للبكتيريا 2,3. هذا النطاق المحدود من الأهداف القابلة للتطبيق يخلق قيودا كبيرة على اكتشاف مضادات حيوية جديدة أو مشتقاتها لمكافحة البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية. وبالتالي ، للتغلب على مشكلة مقاومة المضادات الحيوية الناشئة ، هناك حاجة لتطوير مضادات حيوية جديدة ذات أهداف وآليات عمل جديدة.
يجب أن يكون الهدف المضاد للبكتيريا بشكل مثالي مكونا أساسيا لنمو الخلايا البكتيرية ، وأن يتم حفظه في جميع أنحاء الأنواع المتنوعة من الناحية التطورية ، وأن يظهر أقل تماثل حقيقي النواة ، وأن يكون في متناول المضادات الحيوية4. منذ اكتشاف البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية المشاركة في انقسام الخلايا والحفاظ على شكل الخلية ، ظهرت كنقطة محورية واعدة لتطوير المركبات المضادة للبكتيريا5. هذه البروتينات ضرورية لحيوية البكتيريا وتلعب دورا محوريا في الحفاظ على شكل الخلية (MreB ، CreS) ، والانقسام (FtsZ ، FtsA) ، وفصل الحمض النووي (ParM ، TubZ ، PhuZ ، AlfA) ، على غرار الهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة. والجدير بالذكر أن FtsZ يظهر مستوى عاليا بشكل ملحوظ من الحفظ عبر مجموعة واسعة من الكائنات بدائية النواة ، بينما يوجد MreB في جميع البكتيريا على شكل قضيب تقريبا. هذا التوزيع الواسع والأهمية في صلاحية الخلية يجعل هذه البروتينات هدفا رائعا في أبحاث المضادات الحيوية5،6،7.
من الأهمية بمكان اعتماد نهج متعدد الجوانب يجمع بين الملاحظات في الجسم الحي والتفاعلات في المختبر والتجارب الأنزيمية للتحقق بدقة من صحة بروتينات الهيكل الخلوي البكتيري كهدف أساسي لمثبط محتمل7. الإجراءات الشاقة أو الآثار المترتبة على التكلفة الكبيرة تثقل كاهل العديد من المقايسات المتاحة لهذا الغرض. هذه عقبات ملحوظة أمام استخدامها على نطاق واسع في فحص مركبات الرصاص التي يمكن أن تؤثر على الهيكل الخلوي البكتيري. من بين هذه ، يبرز الفحص المجهري كطريقة فعالة وسريعة بشكل استثنائي لتقييم فعالية المركبات من خلال الفحص المباشر للتغيرات في مورفولوجيا الخلية. ومع ذلك ، فإن الارتباط غير المتجانس للبروتين المستهدف مع مجمعات الهيكل الخلوي الأخرى ، والآثار غير المباشرة بسبب الارتباط خارج الهدف والتغيرات في إمكانات الغشاء ، وصعوبة اختراق الخلية بكفاءة ، ووجود مضخات التدفق ، خاصة في البكتيريا سالبة الجرام ، تجعل الأمر معقدا بشكل جماعي لتحديد السبب الدقيق لتشوه الخلايا البكتيرية8،9،10.
فطرية الفصام بومب، أو خميرة الانشطار كما هو معروف، كائن حقيقي النواة وحيد الخلية على شكل قضيب. تستخدم خميرة الانشطار على نطاق واسع ككائن نموذجي في البيولوجيا الخلوية والجزيئية بسبب الحفظ الاستثنائي في العمليات الخلوية مثل دورة الخلية والانقسام ، والتنظيم الخلوي ، وتكرار الكروموسوم مع حقيقيات النوى الأعلى ، بما في ذلك البشر11,12. علاوة على ذلك ، أعرب Errington وزملاؤه عن بروتين هيكلي خلوي بكتيري موضعي في القطب DivIVA في خميرة الانشطار لإثبات أن DivIVA تراكمت على الأسطح المنحنية سلبا13. مرة أخرى ، أنشأ Balasubramanian والمجموعة لأول مرة خميرة الانشطار كنظام نموذج خلوي لجلب رؤى جديدة حول آلية وتجميع وديناميكية بروتين الهيكل الخلوي E. coli actin مثل MreB14 و tubulin homolog FtsZ15. كما أنها توضح قدرة A22 على إعاقة بلمرة MreB بكفاءة من خلال الفحص المجهري epifluorescence عند التعبير عنها في الخميرة14. بعد ذلك ، نجحت مجموعات أخرى أيضا في استخدام خميرة الانشطار لدراسة خصائص تجميع بروتينات البلاستيدة الخضراء FtsZ1 و FtsZ216. في الآونة الأخيرة ، أنشأنا دليلا على مفهوم جدوى استخدام خميرة الانشطار كمنصة خلوية لفحص مثبطات الهيكل الخلوي البكتيري على وجه التحديد من خلال إجراء تقييم شامل لتأثير ثلاثة مثبطات FtsZ معروفة – سانجوينارين ، بربارين ، وبروتينات FtsZ PC190723 مشتقة من اثنين من البكتيريا المسببة للأمراض ، وهما المكورات العنقودية الذهبية وهيليكوباكتر بيلوري17. بالإضافة إلى ذلك ، يثبت هذا الفحص القائم على الخلية أحادي الخطوة أنه فعال في تقليل مخاطر تحديد المركبات التي قد تكون سامة للخلايا حقيقية النواة.
في هذا التقرير ، باستخدام نظام الخميرة الانشطارية ، نقترح سير عمل منهجي باستخدام لوحة 96 بئرا القياسية للفحص شبه الآلي والقياس الكمي لتأثير مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف FtsZ من المكورات العنقودية الذهبية و MreB من الإشريكية القولونية. هنا ، قمنا بإعداد وتحسين سير العمل شبه الآلي باستخدام مثبطات PC190723 و A22 التي تستهدف على وجه التحديد FtsZ و MreB ، على التوالي. يستخدم سير العمل هذا مجهرا فوق فلوري مزودا بمرحلة عالية الدقة مزودة بمحرك والحصول الآلي على الصور في لوحة قياسية ذات 96 بئرا لتحسين التوحيد الحالي. وبالتالي ، يمكن تطبيقه على الشاشات المتوسطة والعالية الإنتاجية للمكتبات الكيميائية الاصطناعية والتحايل على بعض التحديات المذكورة أعلاه.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشكل مقاومة مضادات الميكروبات تهديدا صحيا عالميا خطيرا، وهناك حاجة ملحة إلى مضادات حيوية جديدة ذات أهداف جديدة. برز الهيكل الخلوي البكتيري كهدف جذاب لتطوير مضادات حيوية جديدة ، مع مثبطات جزيئية صغيرة لبروتين انقسام الخلايا FtsZ ، مثل TXA709 ، بالفعل في المرحلة الأولى من التجارب السريرية<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تعترف SMP و SR و AKS بالزمالات التي تلقتها من المعهد الوطني لتعليم العلوم والبحوث ، قسم الطاقة الذرية. يقر قطاع الأبحاث بدعم التمويل الداخلي من وزارة الطاقة الذرية ، ويتم دعم هذا العمل من خلال منحة بحثية إلى RS (BT / PR42977 / MED/29/1603/2022) من قسم التكنولوجيا الحيوية (DBT). كما يعترف المؤلفون ب V Badireenath Konkimalla لتعليقاته واقتراحاته ومناقشاته طوال فترة تطوير البروتوكول.
Materials
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
| Yeast (S. pombe) media | |||
| Yeast extract + supplements (YES) | |||
| Composition | g/L | ||
| Yeast extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Composition | g/L | concentration | |
| potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
| Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citric acid | 10 | 47.6 mM | |
| Strains/ Plasmids | |||
| Strains | Description | Reference | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
References
- Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
- Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
- Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
- Sanchez, S., Demain, A. L. . Antibiotics: current innovations and future trends. , (2015).
- Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
- Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
- Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
- Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
- Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).
- Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps – not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
- Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
- Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).
- Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
- TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
- Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).
- Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
- Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
- Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
- Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).
- Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
- Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
- Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
- Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
- Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
- Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).
- Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).
- Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. 유전학. 201 (2), 403-423 (2015).
- Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
- Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804 (2022).
