Summary

Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten

Published: April 26, 2024
doi:

Summary

Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Abstract

Bacteriële cytoskeleteiwitten zoals FtsZ en MreB vervullen essentiële functies zoals celdeling en behoud van de celvorm. Verder zijn FtsZ en MreB naar voren gekomen als belangrijke doelen voor nieuwe antimicrobiële ontdekkingen. Er zijn verschillende tests ontwikkeld om verbindingen te identificeren die zich richten op nucleotidebinding en polymerisatie van deze cytoskeleteiwitten, voornamelijk gericht op FtsZ. Bovendien zijn veel van de tests arbeidsintensief of kostenintensief, en om vast te stellen of deze eiwitten het cellulaire doelwit van het medicijn zijn, zijn vaak meerdere methoden nodig. Ten slotte vormt de toxiciteit van de medicijnen voor eukaryote cellen ook een probleem. Hier beschrijven we een eenstaps celgebaseerde test om nieuwe moleculen te ontdekken die gericht zijn op het bacteriële cytoskelet en treffers te minimaliseren die mogelijk giftig kunnen zijn voor eukaryote cellen. Splijtingsgist is vatbaar voor schermen met een hoge doorvoer op basis van microscopie, en een visuele screening kan gemakkelijk elk molecuul identificeren dat de polymerisatie van FtsZ of MreB verandert. Onze test maakt gebruik van de standaard plaat met 96 putjes en vertrouwt op het vermogen van de bacteriële cytoskeleteiwitten om te polymeriseren in een eukaryote cel zoals de splijtingsgist. Hoewel de hier beschreven protocollen voor splijtingsgist zijn en gebruik maken van FtsZ van Staphylococcus aureus en MreB van Escherichia coli, zijn ze gemakkelijk aan te passen aan andere bacteriële cytoskeleteiwitten die gemakkelijk samenvoegen tot polymeren in alle eukaryote expressiegastheren. De hier beschreven methode zou de verdere ontdekking van nieuwe antimicrobiële stoffen gericht op bacteriële cytoskeletale eiwitten moeten vergemakkelijken.

Introduction

De wijdverbreide resistentie tegen bijna alle antibiotica die momenteel worden gebruikt om bacteriële infecties te bestrijden, heeft een onmiddellijke behoefte gecreëerd aan nieuwe categorieën antibiotica. Een rapport uit 2019 gaf aan dat antibioticaresistente infecties resulteerden in het verlies van 1.27 miljoen levens, wat bijdroeg aan een totaal van 4.95 miljoen sterfgevallen wanneer rekening wordt gehouden met complicaties van resistente bacteriële infecties1. Hoewel het nog steeds effectief is in de klinische praktijk, richt het huidige arsenaal aan antibiotica zich voornamelijk op een smal spectrum van cellulaire processen, voornamelijk gericht op celwand-, DNA- en eiwitsynthese. In de afgelopen halve eeuw zijn minder dan 30 eiwitten commercieel geëxploiteerd als doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe antibacteriële middelen 2,3. Dit beperkte aantal levensvatbare doelen creëert aanzienlijke beperkingen voor het ontdekken van nieuwe antibiotica of hun derivaten voor de bestrijding van antibioticaresistente bacteriën. Om het opkomende probleem van antibioticaresistentie op te lossen, is er dus behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe antibiotica met nieuwe doelen en werkingsmechanismen.

Een antibacterieel doelwit zou idealiter een essentieel onderdeel moeten zijn van de groei van bacteriële cellen, geconserveerd moeten blijven in de fylogenetisch diverse soorten, de minste eukaryote homologie moeten vertonen en toegankelijk moeten zijn voor antibiotica. Sinds de ontdekking van bacteriële cytoskeletale eiwitten die betrokken zijn bij celdeling en het behoud van de celvorm, zijn ze naar voren gekomen als een veelbelovend brandpunt voor het ontwikkelen van antibacteriële verbindingen. Deze eiwitten zijn essentieel voor de levensvatbaarheid van bacteriën en spelen een cruciale rol bij het behoud van de celvorm (MreB, CreS), deling (FtsZ, FtsA) en DNA-segregatie (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), vergelijkbaar met het cytoskelet in eukaryote cellen. Met name FtsZ vertoont een opmerkelijk hoog niveau van conservering van een breed scala aan prokaryote organismen, terwijl MreB wordt aangetroffen in bijna alle staafvormige bacteriën. Een dergelijke brede verspreiding en relevantie in de levensvatbaarheid van cellen maken deze eiwitten tot een fascinerend doelwit in antibioticaonderzoek 5,6,7.

Het is van cruciaal belang om een meervoudige aanpak te hanteren die in vivo observaties, in vitro interacties en enzymatische experimenten combineert om bacteriële cytoskeleteiwitten grondig te valideren als het primaire doelwit van een potentiële remmer7. Omslachtige procedures of aanzienlijke kostenimplicaties belasten veel beschikbare tests voor dit doel. Dit zijn opmerkelijke obstakels voor hun wijdverbreide gebruik bij het screenen van loodverbindingen die het bacteriële cytoskelet zouden kunnen beïnvloeden. Hiervan onderscheidt microscopie zich als een uitzonderlijk efficiënte en snelle methode voor het beoordelen van de effectiviteit van verbindingen door veranderingen in de celmorfologie rechtstreeks te onderzoeken. Maar de hetero-associatie van doeleiwit met andere cytoskeletcomplexen, indirecte effecten als gevolg van off-target binding en veranderingen in membraanpotentiaal, moeilijkheid om de cel efficiënt binnen te dringen en de aanwezigheid van effluxpompen, vooral in Gram-negatieve bacteriën, maken het collectief complex om de precieze oorzaak van bacteriële celvervorming vast te stellen 8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, of splijtingsgist zoals het algemeen bekend is, is een staafvormig eencellig eukaryotisch organisme. Splijtingsgist wordt veel gebruikt als modelorganisme in de cellulaire en moleculaire biologie vanwege de buitengewone conservering in cellulaire processen zoals de celcyclus en -deling, cellulaire organisatie en chromosoomreplicatie met hogere eukaryoten, waaronder mensen11,12. Bovendien brachten Errington en collega’s een pool-gelokaliseerd bacterieel cytoskeletaal eiwit DivIVA tot expressie in splijtingsgist om aan te tonen dat DivIVA zich ophoopte op negatief gebogen oppervlakken13. Nogmaals, Balasubramanian en zijn groep hadden voor het eerst splijtingsgist vastgesteld als een cellulair modelsysteem om nieuwe inzichten te krijgen in het mechanisme, de assemblage en de dynamiek van het E. coli-actine-cytoskeleteiwit zoals MreB14 en tubuline-homoloog FtsZ15. Ze tonen ook het vermogen van A22 aan om de polymerisatie van MreB efficiënt te belemmeren door middel van epifluorescentiemicroscopie wanneer het tot expressie wordt gebracht in gist14. Hierna hebben andere groepen ook met succes splijtingsgist gebruikt om de assemblage-eigenschappen van chloroplast FtsZ1- en FtsZ2-eiwitten te bestuderen16. Meer recentelijk hebben we een proof-of-concept opgesteld van de levensvatbaarheid van het gebruik van splijtingsgist als een cellulair platform om specifiek te screenen op bacteriële cytoskeletremmers door een uitgebreide beoordeling uit te voeren van de impact van drie bekende FtsZ-remmers – sanguinarine, berberine en PC190723–op FtsZ-eiwitten afgeleid van twee pathogene bacteriën, namelijk Staphylococcus aureus en Helicobacter pylori17. Bovendien blijkt deze op cellen gebaseerde test in één stap van groot belang te zijn bij het minimaliseren van het risico op het identificeren van verbindingen die mogelijk giftig kunnen zijn voor eukaryote cellen.

In dit rapport stellen we, met behulp van het splijtingsgistsysteem, een systematische workflow voor met behulp van de standaard plaat met 96 putjes voor semi-geautomatiseerde screening en kwantificering van het effect van kleine molecuulremmers gericht op FtsZ van Staphylococcus aureus en MreB van Escherichia coli. Hier zetten we de semi-geautomatiseerde workflow op en optimaliseren we deze met behulp van de gevestigde remmers PC190723 en A22 die zich specifiek richten op respectievelijk FtsZ en MreB. Deze workflow maakt gebruik van een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een gemotoriseerde, zeer nauwkeurige tafel en geautomatiseerde beeldacquisitie in een standaard plaat met 96 putjes om de huidige standaardisatie te verbeteren. Daarom kan het worden toegepast op schermen met zowel gemiddelde als hoge doorvoer van synthetische chemische bibliotheken en omzeilt het enkele van de hierboven genoemde uitdagingen.

Protocol

1. Expressie van GFP-gelabelde bacteriële cytoskeleteiwitten in S. pombe OPMERKING: Zie Tabel 1 voor informatie over alle plasmiden en stammen die hier worden gebruikt. Zie Tabel 2 voor alle mediasamenstellingen. Voer klonen uit van E. coli MreB met een N-terminale GFP-fusie (GFP-MreB) en S. aureus FtsZ met een C-terminale GFP (SaFtsZ-GFP) in de S. pombe-expressievector, pREP42 met een thiamine-r…

Representative Results

Opzetten van de 96-putjes plaat voor het screenen van medicijnenHet gebruik van S. pombe om een C-terminaal GFP-gelabeld S. aureus FtsZ uit een vector (pREP42) die de middelsterke thiamine-repressibele promotor nmt41bevat, is eerder vastgesteld17 en op dezelfde manier werd de E. coli MreB gelabeld met N-terminaal GFP ook tot expressie gebracht in S. pombe14. We hebben ook aangetoond dat PC190723, een specifie…

Discussion

Antimicrobiële resistentie (AMR) is een ernstige wereldwijde bedreiging voor de gezondheid en er is dringend behoefte aan nieuwe antibiotica met nieuwe doelen. Het bacteriële cytoskelet is naar voren gekomen als een aantrekkelijk doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica, met kleine molecuulremmers van het celdelingseiwit FtsZ, zoals TXA709, die zich al in fase I klinische onderzoeken bevinden30. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om remmers van FtsZ-polymerisatie<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SMP, SR en AKS erkennen de beurzen die zijn ontvangen van het National Institute of Science Education and Research, Department of Atomic Energy. RS erkent intramurale financieringssteun van het Department of Atomic Energy, en dit werk wordt ondersteund door een onderzoekssubsidie aan RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) van het Department of Biotechnology (DBT). De auteurs erkennen ook V Badireenath Konkimalla voor zijn opmerkingen, suggesties en discussies tijdens de ontwikkeling van het protocol.

Materials

96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black Thermo Scientific™ 160376
96-well plate Corning   CLS3370
A22 Hydrochloride Sigma  SML0471 Dissolved in DMSO
Adenine FormediumTM DOC0229 225 mg/L of media 
Concanavalin A  Sigma  C5275-5MG
DMSO Sigma  317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) FormediumTM PMD0210 See below for composition
EDTA  Sigma  EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider Eppendorf 5069000101
Histidine FormediumTM DOC0144 225 mg/L of media 
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope Leica Microsystems German company
Leucine FormediumTM DOC0157 225 mg/L of media 
Lithium acetate  Sigma  517992-100G
PC190723 Merck  344580 Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG) Sigma  202398
Thiamine Sigma T4625 Filter sterilised
Tris-Hydrochloride MP 194855
Uracil FormediumTM DOC0214 225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) Agar FormediumTM PCM0410 See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) Broth FormediumTM PCM0310 See below for composition
Yeast (S. pombe) media 
Yeast extract + supplements (YES)
Composition g/L
Yeast extract 5
Dextrose 30
Agar 17
Adenine 0.05
L-Histidine 0.05
L-Leucine 0.05
L-Lysine HCl 0.05
Uracil 0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
Composition g/L concentration
potassium hydrogen phthallate  3 14.7mM
Na2HPO4  2.2 15.5 mM
NH4Cl  5 93.5 mM
glucose 2% (w/v) or 20 g/L  111 mM
Salts (stock x 50) 20 mL/L (v/v)
Vitamins (stock x 1000) 1 mL/L (v/v)
Minerals (Stock x 10,000) 0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50  52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)  52.5 0.26 M
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)  0.000735 4.99 mM
50 g/l KCl (0.67 M)  50 0.67 M
2 g/l Na2SO4 (14.l mM) 2 14.1 mM
Vitamins x 1000  1 g/l pantothenic acid  1 4.20 mM
10 g/l nicotinic acid  10 81.2 mM
10 g/l inositol  10 55.5 mM
10 mg/l biotin  0.01 40.8 µM
Minerals x 10,000  boric acid 5 80.9 mM
MnSO4   4 23.7 mM
ZnSO4.7H2O 4 13.9 mM
FeCl2.6H2O   2 7.40 mM
molybdic acid  0.4 2.47 mM
KI  1 6.02 mM
CuSO4.5H2O  0.4 1.60 mM
citric acid  10 47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains Description Reference
CCD190 Escherichia coli DH10β  Invitrogen
CCDY4  MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB Srinivasan et al., 2007
CCDY340 CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP Sharma et al., 2023
CCDY346 MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3 pREP42-GFP-EcMreB Srinivasan et al., 2007
pCCD713 pREP42-SaFtsZ-GFP Sharma et al., 2023

References

  1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  2. Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
  3. Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
  4. Sanchez, S., Demain, A. L. . Antibiotics: current innovations and future trends. , (2015).
  5. Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
  6. Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
  7. Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
  8. Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
  9. Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).
  10. Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps – not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
  11. Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
  12. Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).
  13. Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
  14. Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
  15. Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
  16. TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
  17. Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).
  18. Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
  19. Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  21. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  22. Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  23. Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).
  26. Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
  27. Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
  28. Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
  29. Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
  30. Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
  31. Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).
  32. Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).
  33. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  34. Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).
  35. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. 유전학. 201 (2), 403-423 (2015).
  36. Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
  37. Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804 (2022).
check_url/kr/66657?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Poddar, S. M., Roy, S., Sharma, A. K., Srinivasan, R. Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins. J. Vis. Exp. (206), e66657, doi:10.3791/66657 (2024).

View Video