Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Bacteriële cytoskeleteiwitten zoals FtsZ en MreB vervullen essentiële functies zoals celdeling en behoud van de celvorm. Verder zijn FtsZ en MreB naar voren gekomen als belangrijke doelen voor nieuwe antimicrobiële ontdekkingen. Er zijn verschillende tests ontwikkeld om verbindingen te identificeren die zich richten op nucleotidebinding en polymerisatie van deze cytoskeleteiwitten, voornamelijk gericht op FtsZ. Bovendien zijn veel van de tests arbeidsintensief of kostenintensief, en om vast te stellen of deze eiwitten het cellulaire doelwit van het medicijn zijn, zijn vaak meerdere methoden nodig. Ten slotte vormt de toxiciteit van de medicijnen voor eukaryote cellen ook een probleem. Hier beschrijven we een eenstaps celgebaseerde test om nieuwe moleculen te ontdekken die gericht zijn op het bacteriële cytoskelet en treffers te minimaliseren die mogelijk giftig kunnen zijn voor eukaryote cellen. Splijtingsgist is vatbaar voor schermen met een hoge doorvoer op basis van microscopie, en een visuele screening kan gemakkelijk elk molecuul identificeren dat de polymerisatie van FtsZ of MreB verandert. Onze test maakt gebruik van de standaard plaat met 96 putjes en vertrouwt op het vermogen van de bacteriële cytoskeleteiwitten om te polymeriseren in een eukaryote cel zoals de splijtingsgist. Hoewel de hier beschreven protocollen voor splijtingsgist zijn en gebruik maken van FtsZ van Staphylococcus aureus en MreB van Escherichia coli, zijn ze gemakkelijk aan te passen aan andere bacteriële cytoskeleteiwitten die gemakkelijk samenvoegen tot polymeren in alle eukaryote expressiegastheren. De hier beschreven methode zou de verdere ontdekking van nieuwe antimicrobiële stoffen gericht op bacteriële cytoskeletale eiwitten moeten vergemakkelijken.
De wijdverbreide resistentie tegen bijna alle antibiotica die momenteel worden gebruikt om bacteriële infecties te bestrijden, heeft een onmiddellijke behoefte gecreëerd aan nieuwe categorieën antibiotica. Een rapport uit 2019 gaf aan dat antibioticaresistente infecties resulteerden in het verlies van 1.27 miljoen levens, wat bijdroeg aan een totaal van 4.95 miljoen sterfgevallen wanneer rekening wordt gehouden met complicaties van resistente bacteriële infecties1. Hoewel het nog steeds effectief is in de klinische praktijk, richt het huidige arsenaal aan antibiotica zich voornamelijk op een smal spectrum van cellulaire processen, voornamelijk gericht op celwand-, DNA- en eiwitsynthese. In de afgelopen halve eeuw zijn minder dan 30 eiwitten commercieel geëxploiteerd als doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe antibacteriële middelen 2,3. Dit beperkte aantal levensvatbare doelen creëert aanzienlijke beperkingen voor het ontdekken van nieuwe antibiotica of hun derivaten voor de bestrijding van antibioticaresistente bacteriën. Om het opkomende probleem van antibioticaresistentie op te lossen, is er dus behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe antibiotica met nieuwe doelen en werkingsmechanismen.
Een antibacterieel doelwit zou idealiter een essentieel onderdeel moeten zijn van de groei van bacteriële cellen, geconserveerd moeten blijven in de fylogenetisch diverse soorten, de minste eukaryote homologie moeten vertonen en toegankelijk moeten zijn voor antibiotica. Sinds de ontdekking van bacteriële cytoskeletale eiwitten die betrokken zijn bij celdeling en het behoud van de celvorm, zijn ze naar voren gekomen als een veelbelovend brandpunt voor het ontwikkelen van antibacteriële verbindingen. Deze eiwitten zijn essentieel voor de levensvatbaarheid van bacteriën en spelen een cruciale rol bij het behoud van de celvorm (MreB, CreS), deling (FtsZ, FtsA) en DNA-segregatie (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), vergelijkbaar met het cytoskelet in eukaryote cellen. Met name FtsZ vertoont een opmerkelijk hoog niveau van conservering van een breed scala aan prokaryote organismen, terwijl MreB wordt aangetroffen in bijna alle staafvormige bacteriën. Een dergelijke brede verspreiding en relevantie in de levensvatbaarheid van cellen maken deze eiwitten tot een fascinerend doelwit in antibioticaonderzoek 5,6,7.
Het is van cruciaal belang om een meervoudige aanpak te hanteren die in vivo observaties, in vitro interacties en enzymatische experimenten combineert om bacteriële cytoskeleteiwitten grondig te valideren als het primaire doelwit van een potentiële remmer7. Omslachtige procedures of aanzienlijke kostenimplicaties belasten veel beschikbare tests voor dit doel. Dit zijn opmerkelijke obstakels voor hun wijdverbreide gebruik bij het screenen van loodverbindingen die het bacteriële cytoskelet zouden kunnen beïnvloeden. Hiervan onderscheidt microscopie zich als een uitzonderlijk efficiënte en snelle methode voor het beoordelen van de effectiviteit van verbindingen door veranderingen in de celmorfologie rechtstreeks te onderzoeken. Maar de hetero-associatie van doeleiwit met andere cytoskeletcomplexen, indirecte effecten als gevolg van off-target binding en veranderingen in membraanpotentiaal, moeilijkheid om de cel efficiënt binnen te dringen en de aanwezigheid van effluxpompen, vooral in Gram-negatieve bacteriën, maken het collectief complex om de precieze oorzaak van bacteriële celvervorming vast te stellen 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, of splijtingsgist zoals het algemeen bekend is, is een staafvormig eencellig eukaryotisch organisme. Splijtingsgist wordt veel gebruikt als modelorganisme in de cellulaire en moleculaire biologie vanwege de buitengewone conservering in cellulaire processen zoals de celcyclus en -deling, cellulaire organisatie en chromosoomreplicatie met hogere eukaryoten, waaronder mensen11,12. Bovendien brachten Errington en collega’s een pool-gelokaliseerd bacterieel cytoskeletaal eiwit DivIVA tot expressie in splijtingsgist om aan te tonen dat DivIVA zich ophoopte op negatief gebogen oppervlakken13. Nogmaals, Balasubramanian en zijn groep hadden voor het eerst splijtingsgist vastgesteld als een cellulair modelsysteem om nieuwe inzichten te krijgen in het mechanisme, de assemblage en de dynamiek van het E. coli-actine-cytoskeleteiwit zoals MreB14 en tubuline-homoloog FtsZ15. Ze tonen ook het vermogen van A22 aan om de polymerisatie van MreB efficiënt te belemmeren door middel van epifluorescentiemicroscopie wanneer het tot expressie wordt gebracht in gist14. Hierna hebben andere groepen ook met succes splijtingsgist gebruikt om de assemblage-eigenschappen van chloroplast FtsZ1- en FtsZ2-eiwitten te bestuderen16. Meer recentelijk hebben we een proof-of-concept opgesteld van de levensvatbaarheid van het gebruik van splijtingsgist als een cellulair platform om specifiek te screenen op bacteriële cytoskeletremmers door een uitgebreide beoordeling uit te voeren van de impact van drie bekende FtsZ-remmers – sanguinarine, berberine en PC190723–op FtsZ-eiwitten afgeleid van twee pathogene bacteriën, namelijk Staphylococcus aureus en Helicobacter pylori17. Bovendien blijkt deze op cellen gebaseerde test in één stap van groot belang te zijn bij het minimaliseren van het risico op het identificeren van verbindingen die mogelijk giftig kunnen zijn voor eukaryote cellen.
In dit rapport stellen we, met behulp van het splijtingsgistsysteem, een systematische workflow voor met behulp van de standaard plaat met 96 putjes voor semi-geautomatiseerde screening en kwantificering van het effect van kleine molecuulremmers gericht op FtsZ van Staphylococcus aureus en MreB van Escherichia coli. Hier zetten we de semi-geautomatiseerde workflow op en optimaliseren we deze met behulp van de gevestigde remmers PC190723 en A22 die zich specifiek richten op respectievelijk FtsZ en MreB. Deze workflow maakt gebruik van een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een gemotoriseerde, zeer nauwkeurige tafel en geautomatiseerde beeldacquisitie in een standaard plaat met 96 putjes om de huidige standaardisatie te verbeteren. Daarom kan het worden toegepast op schermen met zowel gemiddelde als hoge doorvoer van synthetische chemische bibliotheken en omzeilt het enkele van de hierboven genoemde uitdagingen.
Antimicrobiële resistentie (AMR) is een ernstige wereldwijde bedreiging voor de gezondheid en er is dringend behoefte aan nieuwe antibiotica met nieuwe doelen. Het bacteriële cytoskelet is naar voren gekomen als een aantrekkelijk doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica, met kleine molecuulremmers van het celdelingseiwit FtsZ, zoals TXA709, die zich al in fase I klinische onderzoeken bevinden30. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om remmers van FtsZ-polymerisatie<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
SMP, SR en AKS erkennen de beurzen die zijn ontvangen van het National Institute of Science Education and Research, Department of Atomic Energy. RS erkent intramurale financieringssteun van het Department of Atomic Energy, en dit werk wordt ondersteund door een onderzoekssubsidie aan RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) van het Department of Biotechnology (DBT). De auteurs erkennen ook V Badireenath Konkimalla voor zijn opmerkingen, suggesties en discussies tijdens de ontwikkeling van het protocol.
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
96-well plate | Corning | CLS3370 | |
A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
DMSO | Sigma | 317275 | |
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
EDTA | Sigma | EDS-500G | |
epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
Yeast (S. pombe) media | |||
Yeast extract + supplements (YES) | |||
Composition | g/L | ||
Yeast extract | 5 | ||
Dextrose | 30 | ||
Agar | 17 | ||
Adenine | 0.05 | ||
L-Histidine | 0.05 | ||
L-Leucine | 0.05 | ||
L-Lysine HCl | 0.05 | ||
Uracil | 0.05 | ||
Edinburg minimal medium (EMM) | |||
Composition | g/L | concentration | |
potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
KI | 1 | 6.02 mM | |
CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
citric acid | 10 | 47.6 mM | |
Strains/ Plasmids | |||
Strains | Description | Reference | |
CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
Plasmids | |||
pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |