La levure de fission comme plate-forme pour le criblage de médicaments antibactériens ciblant les protéines du cytosquelette bactérien
Summary
La levure de fission est utilisée ici comme hôte hétérologue pour exprimer des protéines cytosquelettiques bactériennes telles que FtsZ et MreB en tant que protéines de fusion translationnelle avec GFP pour visualiser leur polymérisation. De plus, les composés qui affectent la polymérisation sont identifiés par imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence.
Abstract
Les protéines cytosquelettiques bactériennes telles que FtsZ et MreB remplissent des fonctions essentielles telles que la division cellulaire et le maintien de la forme cellulaire. De plus, FtsZ et MreB sont apparus comme des cibles importantes pour la découverte de nouveaux antimicrobiens. Plusieurs tests ont été mis au point pour identifier des composés ciblant la liaison nucléotidique et la polymérisation de ces protéines cytosquelettiques, principalement axés sur FtsZ. De plus, de nombreux tests sont soit laborieux, soit coûteux et nécessitent souvent plusieurs méthodes pour déterminer si ces protéines sont la cible cellulaire du médicament. Enfin, la toxicité des médicaments pour les cellules eucaryotes pose également un problème. Ici, nous décrivons un test cellulaire en une seule étape pour découvrir de nouvelles molécules ciblant le cytosquelette bactérien et minimiser les coups qui pourraient être potentiellement toxiques pour les cellules eucaryotes. La levure de fission se prête aux cribles à haut débit basés sur la microscopie, et un écran visuel peut facilement identifier toute molécule qui modifie la polymérisation de FtsZ ou de MreB. Notre test utilise la plaque standard à 96 puits et repose sur la capacité des protéines cytosquelettiques bactériennes à polymériser dans une cellule eucaryote telle que la levure de fission. Bien que les protocoles décrits ici concernent les levures à fission et utilisent le FtsZ de Staphylococcus aureus et le MreB d’Escherichia coli, ils sont facilement adaptables à d’autres protéines cytosquelettiques bactériennes qui s’assemblent facilement en polymères chez n’importe quel hôte d’expression eucaryote. La méthode décrite ici devrait faciliter la découverte de nouveaux antimicrobiens ciblant les protéines cytosquelettiques bactériennes.
Introduction
La résistance généralisée à presque tous les antibiotiques actuellement utilisés pour lutter contre les infections bactériennes a créé un besoin immédiat de nouvelles catégories d’antibiotiques. Un rapport de 2019 a indiqué que les infections résistantes aux antibiotiques ont entraîné la perte de 1,27 million de vies, contribuant à un décompte global de 4,95 millions de décès si l’on considère les complications des infections bactériennes résistantes1. Bien qu’il soit toujours efficace dans la pratique clinique, l’arsenal actuel d’antibiotiques cible principalement un spectre étroit de processus cellulaires, en se concentrant principalement sur la paroi cellulaire, l’ADN et la synthèse des protéines. Au cours du dernier demi-siècle, moins de 30 protéines ont été exploitées commercialement comme cibles pour le développement de nouveaux antibactériens 2,3. Cette gamme limitée de cibles viables crée des contraintes significatives à la découverte de nouveaux antibiotiques ou de leurs dérivés pour lutter contre les bactéries résistantes aux antibiotiques. Ainsi, pour surmonter le problème émergent de la résistance aux antibiotiques, il est nécessaire de développer de nouveaux antibiotiques avec de nouvelles cibles et de nouveaux mécanismes d’action.
Une cible antibactérienne devrait idéalement être un composant essentiel de la croissance cellulaire bactérienne, être conservée dans toutes les espèces phylogénétiquement diverses, présenter une homologie eucaryote minimale et être accessible aux antibiotiques4. Depuis la découverte de protéines cytosquelettiques bactériennes impliquées dans la division cellulaire et le maintien de la forme cellulaire, elles sont devenues un point focal prometteur pour le développement de composés antibactériens5. Ces protéines sont essentielles à la viabilité bactérienne et jouent un rôle central dans le maintien de la forme cellulaire (MreB, CreS), de la division (FtsZ, FtsA) et de la ségrégation de l’ADN (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), semblable au cytosquelette dans les cellules eucaryotes. Notamment, FtsZ présente un niveau de conservation remarquablement élevé chez un large éventail d’organismes procaryotes, tandis que MreB se trouve dans presque toutes les bactéries en forme de bâtonnet. Une telle distribution et une telle pertinence dans la viabilité cellulaire font de ces protéines une cible fascinante dans la recherche sur les antibiotiques 5,6,7.
Il est crucial d’adopter une approche à plusieurs volets qui combine des observations in vivo, des interactions in vitro et des expériences enzymatiques pour valider en profondeur les protéines du cytosquelette bactérien en tant que cible principale d’un inhibiteur potentiel7. Des procédures laborieuses ou des implications financières importantes alourdissent de nombreux tests disponibles à cette fin. Ce sont des obstacles notables à leur utilisation généralisée dans le criblage des composés principaux qui pourraient avoir un impact sur le cytosquelette bactérien. Parmi celles-ci, la microscopie se distingue par une méthode exceptionnellement efficace et rapide pour évaluer l’efficacité des composés en examinant directement les changements de morphologie cellulaire. Pourtant, l’hétéro-association de la protéine cible avec d’autres complexes du cytosquelette, les effets indirects dus à la liaison hors cible et aux modifications du potentiel membranaire, la difficulté à pénétrer efficacement dans la cellule et la présence de pompes d’efflux, en particulier chez les bactéries à Gram négatif, rendent collectivement complexe l’identification de la cause précise de la déformation cellulaire bactérienne 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, ou levure à fission comme on l’appelle communément, est un organisme eucaryote unicellulaire en forme de bâtonnet. La levure de fission est largement utilisée comme organisme modèle en biologie cellulaire et moléculaire en raison de la conservation extraordinaire des processus cellulaires tels que le cycle et la division cellulaires, l’organisation cellulaire et la réplication des chromosomes chez les eucaryotes supérieurs, y compris les humains11,12. De plus, Errington et ses collègues ont exprimé une protéine cytosquelettique bactérienne localisée au pôle DivIVA dans la levure à fission pour démontrer que DivIVA s’accumulait sur des surfaces à courbure négative13. Encore une fois, Balasubramanian et son groupe ont d’abord établi la levure de fission comme système modèle cellulaire pour apporter de nouvelles connaissances sur le mécanisme, l’assemblage et la dynamique de la protéine du cytosquelette d’actine E. coli comme MreB14 et l’homologue de la tubuline FtsZ15. Ils démontrent également la capacité d’A22 à empêcher efficacement la polymérisation de MreB par microscopie à épifluorescence lorsqu’il est exprimé dans la levure14. Par la suite, d’autres groupes ont également utilisé avec succès des levures de fission pour étudier les propriétés d’assemblage des protéines FtsZ1 et FtsZ216 du chloroplaste. Plus récemment, nous avons établi une preuve de concept de la viabilité de l’utilisation de la levure de fission comme plateforme cellulaire pour dépister spécifiquement les inhibiteurs du cytosquelette bactérien en effectuant une évaluation complète de l’impact de trois inhibiteurs connus de FtsZ – la sanguinarine, la berbérine et PC190723– sur les protéines FtsZ dérivées de deux bactéries pathogènes, à savoir Staphylococcus aureus et Helicobacter pylori17. De plus, ce test cellulaire en une seule étape s’avère essentiel pour minimiser le risque d’identifier des composés potentiellement toxiques pour les cellules eucaryotes.
Dans ce rapport, en utilisant le système de levure à fission, nous proposons un flux de travail systématique utilisant la plaque standard à 96 puits pour le criblage semi-automatisé et la quantification de l’effet des inhibiteurs de petites molécules ciblant FtsZ de Staphylococcus aureus et MreB d’Escherichia coli. Ici, nous mettons en place et optimisons le flux de travail semi-automatisé à l’aide des inhibiteurs établis PC190723 et A22 qui ciblent spécifiquement FtsZ et MreB, respectivement. Ce flux de travail utilise un microscope à épifluorescence équipé d’une platine motorisée de haute précision et d’une acquisition d’image automatisée dans une plaque standard à 96 puits pour améliorer la normalisation actuelle. Par conséquent, il peut être appliqué à des cribles à moyen et à haut débit de bibliothèques chimiques synthétiques et contourne certains des défis énumérés ci-dessus.
Protocol
Representative Results
Discussion
La résistance aux antimicrobiens (RAM) est une grave menace pour la santé mondiale, et il existe un besoin urgent de nouveaux antibiotiques avec de nouvelles cibles. Le cytosquelette bactérien est apparu comme une cible attrayante pour le développement de nouveaux antibiotiques, avec des inhibiteurs de petites molécules de la protéine de division cellulaire FtsZ, tels que TXA709, déjà en essais cliniques de phase I30. Plusieurs méthodes ont été développées pour identifier les inhibite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SMP, SR et AKS reconnaissent les bourses reçues de l’Institut national de l’éducation et de la recherche scientifiques, Département de l’énergie atomique. RS reconnaît le soutien financier intra-muros du Département de l’énergie atomique, et ce travail est soutenu par une subvention de recherche à RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) du Département de biotechnologie (DBT). Les auteurs remercient également V Badireenath Konkimalla pour ses commentaires, suggestions et discussions tout au long de l’élaboration du protocole.
Materials
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
| Yeast (S. pombe) media | |||
| Yeast extract + supplements (YES) | |||
| Composition | g/L | ||
| Yeast extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Composition | g/L | concentration | |
| potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
| Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citric acid | 10 | 47.6 mM | |
| Strains/ Plasmids | |||
| Strains | Description | Reference | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
References
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